Пестицидтер жаһандық азық-түлік тапшылығын шешуде және векторлардан таралатын адам ауруларымен күресуде маңызды рөл атқарады. Дегенмен, пестицидтерге төзімділіктің өсіп келе жатқан мәселесі жеткіліксіз пайдаланылатын нысандарға бағытталған жаңа қосылыстарды ашуды шұғыл түрде талап етеді. Жәндіктердің өтпелі рецепторлық потенциалы (TRPV) арналары — Наньчжун (Нан) және белсенді емес (Иав) — гетерологиялық арналарды (Нан-Иав) түзе алады және жәндіктерде геотропизмді, естуді және проприоцепцияны жүзеге асыратын механосенсорлық органдарға орналасуы мүмкін. Афидопирролидон (АП) сияқты кейбір пестицидтер белгісіз механизмдер арқылы Нань-Иавты нысанаға алады. АП тесіп соратын жәндіктерге (гемиптерандар) қарсы тиімді, жіпшелердің қызметін бұзу арқылы қоректенуге жол бермейді. АП тек Нанмен байланыса алады, бірақ тек Нань-Иав эндогенді никотинамидті (НАМ) қоса алғанда, агонисттермен әрекеттесіп, осылайша арна белсенділігін көрсете алады. Нань-Иавтың инсектицид нысанасы ретіндегі әлеуетіне қарамастан, оның арна жиналуы, реттеуші байланыстыру орындары және Ca2+-тәуелді реттелуі туралы аз мәлімет бар, бұл инсектицидтердің одан әрі дамуына кедергі келтіреді. Бұл зерттеуде криоэлектронды микроскопия Hemiptera жәндіктеріндегі Nan-Iav құрылымын кальмодулин-лигандсыз күйде, сондай-ақ анкирин қайталанатын цитоплазмалық домен (ARD) шекарасында AP және NAM бар күйде анықтау үшін қолданылды. Таңқаларлығы, біз Nan ақуызының өзі AP арқылы жүзеге асырылатын ARD өзара әрекеттесулері арқылы тұрақтандырылатын пентамер түзе алатынын анықтадық. Бұл зерттеу инсектицидтер мен агонисттер мен Nan-Iav арасындағы молекулалық өзара әрекеттесуді ашады, ARD арна функциясы мен жиналуындағы маңыздылығын көрсетеді және Ca2+ реттелу механизмін зерттейді.
Әлемдік климаттың өзгеруінің күшеюі аясында жаһандық азық-түлік қауіпсіздігінің нашарлауы ХХІ ғасырдың негізгі қиындықтарының бірі болып табылады, бұл қоғам үшін каскадты салдарға әкеп соғады.1,2Дүниежүзілік денсаулық сақтау ұйымының «Әлемдегі азық-түлік қауіпсіздігі мен тамақтанудың 2023 жылғы жағдайы» (SOFI) есебінде әлемде шамамен 2,33 миллиард адам орташа және ауыр азық-түлік қауіпсіздігінің жетіспеушілігінен зардап шегетіні, бұл ұзақ уақыт бойы жалғасып келе жатқан мәселе екені айтылған.3,4Өкінішке орай, жыл сайын зиянкестер мен патогендер дақылдардың өнімділігінің шамамен 20%-дан 30%-ға дейін немесе одан да көбін жоғалтады, ал жаһандық жылыну зиянкестерге төзімділік пен дақылдардың осалдығын күшейтеді деп күтілуде.4,5,6,7,8Пестицидтерді әзірлеу тек дақылдарды зиянкестерден қорғау және векторлық патогендер таралуын азайту үшін ғана емес, сонымен қатар пестицидтерге төзімділігі артып келе жатқан денге безгегі, безгек және Шагас ауруы сияқты векторлық адам ауруларымен күресу үшін де өте маңызды.5,9,10,11
Нейротоксикалық инсектицидтердің негізгі нысаналарының арасында гетеротетрамерлі TRPV арнасы Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) соңғы онжылдықта ғана анықталған инсектицид нысаналарының класын білдіреді, оның ішінде имидаклоприд және пираклостробин сияқты коммерциялық қолжетімді инсектицидтер бар.12,13,14Жартылай синтетикалық афидопирролифен (AP) инсектициді жақында жасалған және коммерцияланған өнім болып табылады, оның негізгі компоненті AP-ны субнаномолярлық белсенділік деңгейінде байланыстыратын белсенді инсектицид Inscalis® болып табылады.15AP тозаңдандырғыштарға, пайдалы жәндіктерге және басқа да нысана емес организмдерге төмен жедел уыттылық көрсетеді және заттаңбадағы нұсқауларға сәйкес қолданылған кезде басқа инсектицидтерге төзімділік қысымын төмендетуі мүмкін.16,17,18Nan және Iav жәндіктер түрлерінде кең таралған, тек антенналар мен аяқ-қолдардың хордалық созылу рецепторлық нейрондарында ғана бірге экспрессияланады және есту, гравитацияны қабылдау және проприоцепция үшін өте маңызды.13,16,19,20,21,22АП, имидаклоприд және пираклостробин Nan-Iav кешенін бірегей механизм арқылы ынталандырады, сайып келгенде проприоцептивті сигналдың берілуін тежейді.13,16,23Тли және ақ шыбындар сияқты тесіп соратын жәндіктерде (гемиптерандарда) проприоцепцияның жоғалуы олардың қоректену қабілетін төмендетеді, сайып келгенде өлімге әкеледі.13,24Қызығы, AP Nan-Iav кешеніне жоғары аффинділік, ал тек Nan-ға төмен аффинділік көрсетеді. AP-ның Nan-Iav-ға байланысуы электр тогын тудырады, бірақ тек Nan-ға байланысу арна белсенділігін ынталандырмайды. Iav-тың өзі AP-ға мүлдем байланыспайды.16Бұл Nan және Iav әртүрлі Nan-Iav арналық кешендерінің түзілуіне байланысты болуы мүмкін екенін (мысалы, әртүрлі стехиометриялық қатынастармен немесе бірдей стехиометриялық қатынас шеңберіндегі әртүрлі орналасулармен) немесе AP бірнеше жерге байланысуы мүмкін екенін көрсетеді. Сонымен қатар, табиғи никотинамид агонисті (NAM) Drosophila Nan-Iav-пен микромолярлық аффинділікпен байланысады, in vitro жағдайында тлилерге (AP) ұқсас әсерлер көрсетеді.16,25және тлидің көбеюі мен қоректенуін тежейді, сайып келгенде олардың өліміне әкеледі25,26Бұл деректер көптеген сұрақтар туғызады. Мысалы, Nan-Iav гетеродимери қалай түзілетіні, ұсақ молекулаларды модуляциялау үшін қандай байланыс орындары қолданылатыны және бұл ұсақ молекулалардың проприоцепцияны басу арқылы арна функциясын қалай реттейтіні белгісіз болып қала береді. Сонымен қатар, Nan-ның өзінің белсенді емес және AP-ға төмен аффинділігінің болуының, ал Nan-Iav гетеродимери белсенді және AP-ны жоғары аффинділікпен байланыстыруының себептері әлі күнге дейін түсініксіз. Соңында, Nan-Iav функциясының Ca2+-тәуелді реттелуі және оның нейрондық сигнал беру процестеріне қалай интеграцияланатыны туралы аз мәлімет бар.13,21
Бұл зерттеуде криоэлектронды микроскопияны, электрофизиологияны және радиолигандты байланыстыру әдістерін біріктіре отырып, біз Nan-Iav жиналуын және оның шағын молекулалық реттегіштерге байланысу механизмін түсіндірдік. Сонымен қатар, біз Iav және AP-тұрақтандырылған Nan пентамерлеріне конститутивті түрде байланысқан кальмодулинді (CaM) анықтадық. Бұл нәтижелер каналдардағы кальций иондарының реттелуі, канал жиналуы және лигандтың байланысу аффинділігін анықтайтын факторлар туралы маңызды түсінік береді. Ең бастысы, біз ARD бұл процестерде орталық рөл атқаратынын растадық. Тиісті ауылшаруашылық пестицидтерімен байланысқан толық жәндіктер каналдарын зерттеуіміз.27, 28, 29пестицидтер өнеркәсібін дамытуға, пестицидтердің тиімділігі мен ерекшелігін арттыруға және жаһандық азық-түлік қауіпсіздігі мен векторлық аурулардың таралуын шешу үшін TRPV-ға бағытталған қосылыстарды басқа түрлерге қолдануға мүмкіндік береді.
Біз сондай-ақ Nan-Iav Ca2+ арқылы реттелетінін және реттеу механизмі конститутивті түрде байланысқан CaM арқылы жүзеге асатынын анықтадық. Маңыздысы, CaM арқылы Nav-тың Ca2+-тәуелді реттелуі басқа иондық арналардың (мысалы, кернеумен басқарылатын Na+ арналары және TRPV5/6 арналары) реттелу механизмдерінен айтарлықтай ерекшеленеді.52,53,54,55,56,57Nav1.2 арнасында CaM-нің С-терминалды домені С-терминалды доменмен (CTD) спиральды түрде байланысады, ал Ca2+ өзінің N-терминалды доменінің CTD дистальды бөлігіне байланысуын индукциялайды.56TRPV5/6 арнасында CaM-нің С-терминалды домені CTH-мен байланысады, ал Ca2+ өзінің N-терминалды доменінің кеуекке жоғары қарай созылуын тудырады, осылайша катион өткізгіштігін блоктайды.53,54Біз Nan-Iav-CaM-нің Ca2+-реттелетін функциясының моделін ұсынамыз (4h сурет). Бұл модельде CaM-нің N-терминалды домені Iav-дің C-терминалды доменіне (CTH) конститутивті түрде байланысады. Тыныштық күйінде (төмен [Ca2+] концентрациясы), CaM-нің C-терминалды домені Nan-мен әрекеттеседі, ARD конформациясын тұрақтандырады және осылайша арнаның ашылуын ынталандырады. Агонист/инсектицидтің арнаға байланысуы тесіктердің ашылуын тудырады, бұл Ca2+ ағынына әкеледі. Содан кейін Ca2+ CaM-мен байланысады, бұл Nan ARD-дан C-терминалды доменнің диссоциациялануын тудырады. CaM байланысын блоктау Ca2+-тің тежеу әсерін негізінен жоятындықтан, бұл диссоциация ARD қозғалғыштығын модуляциялайды, осылайша Ca2+-тәуелді тежеуді немесе десенсибилизацияны тудырады. Кальций иондарын элюциялаудан кейін арна токтарының тез қалпына келуі (4g сурет) бұл механизмнің Ca2+-арқылы нейрондық сигналдарға жылдам жауап беруін жеңілдететінін көрсетеді. Сонымен қатар, әлі күнге дейін аз зерттелген Iav-тың C-терминалды аймағы арнаны нысанаға алуда және ағымдағы реттеуде басқа рөл атқаратыны туралы хабарланған.21
Соңында, біздің зерттеуіміз ауылшаруашылық маңызы бар инсектицид-инсектицидті TRP арна кешенінің жоғары ажыратымдылықтағы құрылымын ұсынады - бұл бізге бұрын белгісіз жаңалық. Атап айтқанда, біз жәндіктер арнасының жәндіктер жасушаларындағы емес, адам жасушаларындағы (HEK293S GnTi–) құрылымы мен қызметін сипаттадық. Инсектицидтерге төзімділіктің артуы және азық-түлік қауіпсіздігі мен патогендерге үнемі қысым жасалып жатқан жағдайда, біздің жұмысымыз адам денсаулығы мен жаһандық азық-түлік қауіпсіздігі үшін жаңа инсектицидтерді әзірлеуге ықпал ететін маңызды ақпарат береді. Зерттеулер AP сияқты инсектицидтердің жапсырмадағы нұсқауларға сәйкес қолданылған кезде кейбір зиянкестерге қарсы тиімді екенін және пайдалы тозаңдандырғыштарға өткір уыттылығы төмен екенін, бұл олардың экологиялық қауіпсіздігін көрсететінін көрсетті.13,16Сонымен қатар, кейбір AP туындыларын масаларға сынау олардың ақырында ұшу қабілетін жоғалтатынын көрсетті. Бұл модуляцияланатын қосылыстардың Nan-Iav-пен қалай байланысатынын түсіну қолданыстағы қосылыстарды модификациялауға немесе тиімдірек және тиімдірек болу үшін жаңа қосылыстарды әзірлеуге ықпал етеді.дәлзиянкестермен күрес. Біздің зерттеуіміз Nan-Iav ARD интерфейсінің тек эндогендік қосылыстардың, пестицидтердің және Ca2+-CaM белсенділігін реттеу үшін ғана емес, сонымен қатар каналдарды жинау үшін де маңызды екенін көрсетеді. Біз иондық каналдардың ингибиторларын әзірлеу үшін шағын молекулалармен гетеродимерлерді жинауды бұзу бірегей және перспективалы тәсіл болуы мүмкін деп болжаймыз.
Сегіз ортологты геннің ішінен қоңыр қоңыздың (Halyomorpha halys) толық ұзындықтағы гендері Nanchung және Inactive таңдалды, олар жуғыш заттарда тамаша тұрақтылық көрсетті. Синтезделген гендер адам экспрессиясы үшін кодонмен оңтайландырылды және XhoI және EcoRI рестрикциялық сайттарын пайдаланып pBacMam pCMV-DEST векторына (Life Technologies) клондалды. Бұл клондардың HRC-3C протеазасымен (PPX) бөлінетін C-терминалды GFP-FLAG-10xHis және mCherry-FLAG-10xHis тегтерімен кадрда болуын қамтамасыз етті, бұл тәуелсіздікке мүмкіндік береді.өрнекNanchung және Inactive-ті pBacMam векторына клондау үшін қолданылған праймерлер келесідей болды:
Жеке бөлшектердің микроскопиялық суреттері K3 камерасымен және Gatan BioQuantum энергия сүзгісімен жабдықталған Titan Krios G2 беріліс электронды микроскопында (FEI) алынды. Микроскоп 300 кэВ кернеуде, энергия параметрі 20 эВ, үлгі пикселінің өлшемі 1,08 Å/пиксель (номиналды үлкейту 81 000x) және дефокус градиенті -0,8-ден -2,2 мкм-ге дейін жұмыс істеді. Бейнежазба номиналды доза жылдамдығы 25 e–px−1 s−1, экспозиция уақыты 2,4 с және жалпы дозасы шамамен 60 e–Å−2 болатын Latitude S микроскопын (Gatan) пайдаланып секундына 40 кадр жиілігінде жүргізілді.
Сәуле тудыратын қозғалыс түзетуі және дозаны өлшеу RELION 4.061 бағдарламасындағы MotionCor2 көмегімен пленкада орындалды. Контраст беру функциясының (CTF) параметрін бағалау cryoSPARC бағдарламасында патч негізіндегі CTF бағалау әдісін қолдану арқылы орындалды62. CTF сәйкестендіру ажыратымдылығы ≥4 Å болатын фотомикрографтар кейінгі талдаудан алынып тасталды. Әдетте, cryoSPARC бағдарламасында нүктені таңдау үшін 500–1000 фотомикрографтардың жиынтығы пайдаланылды, содан кейін шаблон негізіндегі бөлшектерді таңдау үшін айқын анықтамалық кескін алу үшін сүзгіден өткізгеннен кейін 2D жіктеудің бірнеше кезеңі жүргізілді. Содан кейін бөлшектер 64 пиксельді шектеу қораптары және 4 бүктелген биннинг арқылы алынды. Қажетсіз бөлшектер санаттарын жою үшін 2D жіктеудің бірнеше кезеңі орындалды. Бастапқы 3D моделі ab initio реконструкциясын қолдану арқылы қайта құрылды және cryoSPARC бағдарламасында біркелкі емес жетілдіру арқылы жетілдірілді. 3D жіктеу cryoSPARC немесе RELION бағдарламасында ARD гетерогенділігіне негізделген орындалды. Мембрана домендерінің айтарлықтай гетерогенділігі байқалмады. Бөлшектер C1 және C2 әдістерін қолдана отырып тазартылды; C2 ажыратымдылығы жоғары бөлшектер C2-ге қатысты симметриялы деп саналды және байес әдісімен тазарту үшін RELION-ға импортталды. Содан кейін бөлшектер соңғы біркелкі емес және жергілікті тазарту үшін криоSPARC-қа қайтарылды. Соңғы ажыратымдылық және бөлшектер саны 1-кестеде көрсетілген.
Nan+AP пентамерлерін өңдеу кезінде біз мембраналық домендердің (әсіресе кеуек аймағының) ажыратымдылығын жақсартудың әртүрлі әдістерін, мысалы, сигналды азайту және TMD маскасын жасауды зерттедік. Дегенмен, бұл әрекеттер кеуек аймағындағы ықтимал экстремалды бұзылуларға және TMD жалпы гетерогенділігіне байланысты сәтсіз аяқталды. Соңғы ажыратымдылық криоСПАРК-та біркелкі емес өңдеу әдісімен автоматты түрде жасалған масканы пайдаланып есептелді, негізінен ARD аймағына бағытталған. Бұл мембраналық домендерге (әсіресе VSLD аймағына) қарағанда айтарлықтай жоғары ажыратымдылыққа қол жеткізді.
Наньчунг және белсенді емес қателіктердің апо формаларының бастапқы de novo модельдері алдымен Coot63 көмегімен жасалды, ал Нан және Иав қателіктерінің модельдері төмен сенімділік аймақтарын анықтау үшін AlphaFold264 көмегімен жасалды. Кальмодулинді модельдеу PDB 4JPZ56 және 1CFD65 үлгілеріндегі Ca2+-байланыстырушы және Ca2+-сыз модельдердің қатты денеге сәйкес келуіне негізделген. Модельдер дұрыс стереохимия мен жақсы геометрияны қамтамасыз ету үшін сфералық нақтылауды қолдана отырып жетілдірілді. Содан кейін фосфатидилхолин, фосфатидилетаноламин және фосфатидилсерин жақсы анықталған липидтік тығыздық ретінде модельденді, ал NAM және AP лигандтары тығыз түйіспелердегі тиісті тығыздықтарға орналастырылды. PHENIX66 ішіндегі eLBOW көмегімен изоформалардың SMILES тізбегінен шектеу файлдары жасалды. Соңында, модельдер PHENIX ішіндегі нақты кеңістікте жергілікті тор іздеу және екінші реттік құрылым шектеулерімен жаһандық минимизацияны қолдана отырып жетілдірілді. Модельді нақтылау және құрылымдық талдау үшін MolProbity сервері пайдаланылды, ал иллюстрациялар PyMOL және UCSF Chimera X көмегімен орындалды. 67,68,69 Диафрагма талдауы HOLE сервері арқылы орындалды70 және тізбекті сақтау картасы Consurf сервері арқылы орындалды71.
Статистикалық талдау Igor Pro 6.2, Excel Office 365 және GraphPad Prism 7.0 бағдарламаларын пайдаланып жүргізілді. Барлық сандық деректер орташа ± стандартты қателік (SEM) ретінде ұсынылған. Екі топты салыстыру үшін Стьюденттің t-тестісі (екі жақты, жұпсыз) қолданылды. Бірнеше топты салыстыру үшін бір жақты дисперсиялық талдау (ANOVA) және одан кейін Даннетттің пост-хок тесті қолданылды. *P< 0,05, **P< 0,01 және ***P< 0,001 деректер таралуына байланысты статистикалық тұрғыдан маңызды деп саналды. Kd, Ki мәндері және олардың асимметриялық 95% сенімділік аралықтары GraphPad Prism 10 көмегімен есептелді.
Зерттеу әдістемесі туралы қосымша ақпарат алу үшін осы мақалада сілтеме жасалған Табиғат портфолиосы туралы есептің қысқаша мазмұнын қараңыз.
Бастапқы модель PDB 4JPZ және 1CFD дерекқорларынан алынған кальмодулин модельдерін пайдалану арқылы жасалды. Координаттар Ақуыз деректер банкіне (PDB) 9NVN (лигандсыз Nan-Iav-CaM), 9NVO (никотинамидпен байланысқан Nan-Iav-CaM), 9NVP (никотинамидпен және EDTA-мен байланысқан Nan-Iav-CaM), 9NVQ (афенидолпирроллинмен және кальциймен байланысқан Nan-Iav-CaM), 9NVR (афенидолпирроллинмен және EDTA-мен байланысқан Nan-Iav-CaM) және 9NVS (афенидолпирроллинмен байланысқан Nan пентамері) тіркеу нөмірлерімен сақталды. Тиісті криоэлектронды микроскопия кескіндері Электронды микроскопия дерекқорына (EMDB) келесі тіркеу нөмірлерімен сақталады: EMD-49844 (лигандсыз Nan-Iav-CaM), EMD-49845 (никотинамид қосылған Nan-Iav-CaM кешені), EMD-49846 (никотинамид және ЭДТА қосылған Nan-Iav-CaM кешені), EMD-49847 (афидопирроллин және кальций қосылған Nan-Iav-CaM кешені), EMD-49848 (афидопирроллин және ЭДТА қосылған Nan-Iav-CaM кешені) және EMD-49849 (афидопирроллин қосылған Nan пентамер кешені). Функционалдық талдауға арналған шикізат деректері осы мақалада келтірілген.
Жарияланған уақыты: 2026 жылғы 28 қаңтар