Антигельминтикалық препарат N,N-диэтил-м-толуамид (DEET) AChE (ацетилхолинэстераза) тежейтіні және шамадан тыс тамырлануға байланысты канцерогендік қасиеттері бар екені туралы хабарланған. Бұл мақалада біз DEET ангиогенезді ынталандыратын эндотелий жасушаларын арнайы ынталандыратынын, осылайша ісіктің өсуін арттыратынын көрсетеміз. DEET ангиогенезге әкелетін жасушалық процестерді, соның ішінде пролиферацияны, миграцияны және адгезияны белсендіреді. Бұл эндотелий жасушаларында NO өндірісінің және VEGF экспрессиясының артуымен байланысты. M3-ті өшіру немесе фармакологиялық M3 ингибиторларын қолдану осы әсерлердің барлығын жойды, бұл DEET-индукцияланған ангиогенездің M3-ке сезімтал екенін көрсетеді. M3 рецепторларын шамадан тыс экспрессиялайтын эндотелий және HEK жасушаларындағы кальций сигнализациясын қамтитын тәжірибелер, сондай-ақ байланыстыру және бекіту зерттеулері DEET M3 рецепторларының аллостериялық модуляторы ретінде әрекет ететінін көрсетеді. Сонымен қатар, DEET AChE-ді тежейді, осылайша ацетилхолиннің биожетімділігін және оның M3 рецепторларымен байланысуын арттырады және аллостериялық реттеу арқылы проангиогендік әсерлерді күшейтеді.
Бастапқы ЭК швейцариялық тышқандардың қолқасынан бөлініп алынды. Экстракция әдісі Кобаяши хаттамасынан бейімделген 26. Тышқан ЭК төртінші өтуге дейін 5% жылумен инактивтелген FBS қосылған EBM-2 ортасында өсірілді.
HUVEC, U87MG немесе BF16F10 пролиферациясына екі концентрациядағы DEET әсері CyQUANT жасуша пролиферациясын талдау жинағын (Molecular Probes, C7026) пайдаланып талданды. Қысқаша айтқанда, әр ұяшыққа 5,103 жасуша 96 ұяшықты пластинаға себіліп, түні бойы бекітіліп, содан кейін 24 сағат бойы DEET-пен өңделді. Өсіру ортасын алып тастағаннан кейін, микропластинаның әрбір ұяшығына бояғыш байланыстырушы ерітіндіні қосып, жасушаларды 37 °C температурада 30 минут инкубациялаңыз. Флуоресценция деңгейлері 485 нм қоздыру сүзгілерімен және 530 нм эмиссиялық сүзгілерімен жабдықталған Mithras LB940 көп режимді микропластина оқу құрылғысын (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Германия) пайдаланып анықталды.
HUVEC 96 ұяшықты пластиналарға әр ұяшыққа 104 жасуша тығыздығында себілді. Жасушалар 24 сағат бойы DEET-пен өңделді. Жасушалардың тіршілік қабілеті колориметриялық MTT талдауын (Sigma-Aldrich, M5655) қолдану арқылы бағаланды. Оптикалық тығыздық мәндері көп режимді микропластиналы оқу құрылғысында (Mithras LB940) 570 нм толқын ұзындығында алынды.
DEET әсерлері in vitro ангиогенез талдауларын қолдану арқылы зерттелді. 10-8 M немесе 10-5 M DEET-пен емдеу HUVEC-терде капилляр ұзындығының түзілуін арттырды (1a, b сурет, ақ жолақтар). Бақылау тобымен салыстырғанда, 10-14-тен 10-5 M-ге дейінгі DEET концентрацияларымен емдеу капилляр ұзындығының 10-8 M DEET кезінде платоға жеткенін көрсетті (қосымша S2 сурет). 10-8 M және 10-5 M концентрация диапазонында DEET-пен өңделген HUVEC-тердің in vitro проангиогендік әсерінде айтарлықтай айырмашылық табылған жоқ.
DEET-тің неоваскуляризацияға әсерін анықтау үшін біз in vivo неоваскуляризация зерттеулерін жүргіздік. 14 күннен кейін 10-8 М немесе 10-5 М DEET-пен алдын ала өсірілген эндотелий жасушалары енгізілген тышқандарда гемоглобин мөлшерінің айтарлықтай артуы байқалды (1c-сурет, ақ жолақтар).
Сонымен қатар, DEET индукцияланған неоваскуляризациясы U87MG ксенотрансплантаттары бар тышқандарда зерттелді, оларға күн сайын (ip) DEET плазмалық концентрациясын 10-5 М индукциялайтын дозада енгізілді, бұл әсер еткен адамдарда қалыпты жағдай. 23-те. Анықталатын ісіктер (яғни, >100 мм3 ісіктер) тышқандарға U87MG жасушаларын енгізгеннен кейін 14 күннен кейін байқалды. 28-ші күні DEET-пен өңделген тышқандарда ісіктің өсуі бақылау тышқандарымен салыстырғанда айтарлықтай артты (1d-сурет, шаршылар). Сонымен қатар, ісіктердің CD31 бояуы DEET капиллярлық ауданды айтарлықтай арттырғанын, бірақ микротамырлар тығыздығын арттырмағанын көрсетті (1e-g сурет).
Мускариндік рецепторлардың DETA-индукцияланған пролиферациядағы рөлін анықтау үшін pFHHSiD (10-7 M, селективті M3 рецепторларының антагонисті) қатысуымен 10-8 M немесе 10-5 M DETA қолданылды. HUVEC-пен емдеу. pFHHSiD барлық концентрацияларда DETA пролиферациялық қасиеттерін толығымен блоктады (1-кесте).
Осы жағдайларда біз DEET HUVEC жасушаларында капиллярлардың ұзындығын арттыратынын да зерттедік. Сол сияқты, pFHHSiD DEET тудырған капиллярлардың ұзындығын айтарлықтай болдырмады (1a, b сурет, сұр жолақтар). Сонымен қатар, ұқсас тәжірибелер M3 siRNA-мен жүргізілді. Бақылау siRNA капиллярлардың түзілуін ілгерілетуде тиімді болмаса да, M3 мускариндік рецепторын өшіру DEET-тің капиллярлардың ұзындығын арттыру мүмкіндігін жойды (1a, b сурет, қара жолақтар).
Сонымен қатар, 10-8 М немесе 10-5 М DEET индукцияланған in vitro тамырлану және in vivo неоваскуляризация pFHHSiD арқылы толығымен блокталды (1c, d сурет, шеңберлер). Бұл нәтижелер DEET селективті M3 рецепторларының антагонистеріне немесе M3 siRNA-ға сезімтал жол арқылы ангиогенезді ілгерілететінін көрсетеді.
AChE DEET-тің молекулалық нысанасы болып табылады. AChE ингибиторлары ретінде әрекет ететін донепезил сияқты препараттар in vitro және тышқанның артқы аяқ ишемиясы модельдерінде EC ангиогенезін ынталандыруы мүмкін14. Біз HUVEC-те AChE ферментінің белсенділігіне DEET-тің екі концентрациясының әсерін тексердік. DEET-тің төмен (10-8 M) және жоғары (10-5 M) концентрациялары бақылау жағдайларымен салыстырғанда эндотелий AChE белсенділігін төмендетті (2-сурет).
DEET екі концентрациясы да (10-8 M және 10-5 M) HUVEC-тегі ацетилхолинэстераза белсенділігін төмендетті. BW284c51 (10-5 M) ацетилхолинэстераза ингибиторларын бақылау ретінде пайдаланылды. Нәтижелер HUVEC-тегі DEET екі концентрациясымен өңделген AChE белсенділігінің көлікпен өңделген жасушалармен салыстырғандағы пайызы ретінде көрсетілген. Мәндер алты тәуелсіз эксперименттің орташа ± SEM ретінде көрсетілген. *p < 0,05 бақылаумен салыстырғанда (Крускал-Уоллис және Данн көптік салыстыру сынағы).
Азот оксиді (NO) ангиогендік процеске 33 қатысады, сондықтан DEET-стимуляцияланған HUVEC-терде NO өндірісі зерттелді. DEET-пен өңделген эндотелий NO өндірісі бақылау жасушаларымен салыстырғанда артты, бірақ маңыздылығы тек 10-8 М дозада ғана жетті (3c-сурет). DEET-индукцияланған NO өндірісін басқаратын молекулалық өзгерістерді анықтау үшін eNOS экспрессиясы мен белсенділігі вестерн-блоттинг арқылы талданды. DEET-пен емдеу eNOS экспрессиясын өзгертпесе де, ол eNOS фосфорлануындағы өңделмеген жасушалармен салыстырғанда белсендіру орнында (Ser-1177) eNOS фосфорлануын айтарлықтай арттырды, ал ингибиторлық орнын (Thr-495) төмендетті (3d-сурет). Сонымен қатар, белсендіру орнында және ингибиторлық орнында фосфорланған eNOS-тың қатынасы фосфорланған eNOS мөлшерін ферменттің жалпы мөлшеріне қалыпқа келтіргеннен кейін есептелді. Бұл қатынас DEET-тің әрбір концентрациясымен өңделген HUVEC-терде өңделмеген жасушалармен салыстырғанда айтарлықтай артты (3d-сурет).
Соңында, негізгі проангиогендік факторлардың бірі болып табылатын VEGF экспрессиясы вестерн-блоттинг арқылы талданды. DEET VEGF экспрессиясын айтарлықтай арттырды, ал pFHHSiD бұл экспрессияны толығымен блоктады.
DEET әсерлері фармакологиялық блокадаға да, M3 рецепторларының төмендеуіне де сезімтал болғандықтан, біз DEET кальций сигналын күшейтуі мүмкін деген гипотезаны тексердік. Таңқаларлығы, DEET қолданылған екі концентрация үшін де HUVEC (деректер көрсетілмеген) және HEK/M3 (4a, b сурет) цитоплазмалық кальцийді арттыра алмады.
Жарияланған уақыты: 2024 жылғы 30 желтоқсан