Антигельминтикалық препарат N,N-диэтил-м-толуамид (DEET) AChE (ацетилхолинэстераза) тежейтіні және шамадан тыс васкуляризацияға байланысты потенциалды канцерогендік қасиеттерге ие екендігі хабарланды. Бұл мақалада біз DEET арнайы ангиогенезге ықпал ететін эндотелий жасушаларын ынталандыратынын және осылайша ісік өсуін арттыратынын көрсетеміз. DEET ангиогенезге әкелетін жасушалық процестерді белсендіреді, соның ішінде пролиферация, миграция және адгезия. Бұл эндотелий жасушаларында NO өндірісінің жоғарылауымен және VEGF экспрессиясымен байланысты. M3 дыбысын өшіру немесе фармакологиялық M3 тежегіштерін қолдану осы әсерлердің барлығын жойды, бұл DEET-индукцияланған ангиогенездің M3-сезімтал екенін көрсетеді. M3 рецепторларын шамадан тыс экспрессиялайтын эндотелий және HEK жасушаларында кальций сигнализациясын қамтитын эксперименттер, сондай-ақ байланыстыру және қондыру зерттеулері DEET M3 рецепторларының аллостериялық модуляторы ретінде әрекет ететінін көрсетеді. Сонымен қатар, DEET AChE тежейді, осылайша ацетилхолиннің биожетімділігін және оның M3 рецепторларымен байланысуын арттырады және аллостериялық реттеу арқылы проангиогендік әсерді күшейтеді.
Бастапқы ЭК-лар швейцариялық тышқандардың қолқасынан бөлініп алынды. Экстракция әдісі Кобаяши 26 хаттамасынан бейімделген. Тышқан ЭК-тері төртінші өтуге дейін 5% жылумен белсендірілмеген FBS қосылған EBM-2 ортада өсірілді.
DEET екі концентрациясының HUVEC, U87MG немесе BF16F10 пролиферациясына әсері CyQUANT жасуша пролиферациясын талдау жинағы (Молекулалық зондтар, C7026) арқылы талданды. Қысқаша айтқанда, әр ұңғымаға 5,103 ұяшық 96 шұңқырлы пластинаға егілді, түнде бекітуге рұқсат етілді, содан кейін 24 сағат бойы DEET өңделеді. Өсіру ортасын алып тастағаннан кейін микропластинаның әрбір ұңғымасына бояғышты байланыстыратын ерітінді қосып, жасушаларды 37 °C температурада 30 минут инкубациялаңыз. Флуоресценция деңгейлері 485 нм қоздыру сүзгілерімен және 530 нм эмиссия сүзгілерімен жабдықталған Mithras LB940 мультимодалы микропластиналық оқу құралының (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Германия) көмегімен анықталды.
HUVEC бір ұңғымаға 104 ұяшық тығыздығымен 96 шұңқырлы тақталарға себілді. Жасушалар 24 сағат бойы DEET-пен өңделген. Жасушаның өміршеңдігі колориметриялық MTT талдауы арқылы бағаланды (Sigma-Aldrich, M5655). Оптикалық тығыздық мәндері 570 нм толқын ұзындығында мультимодалы микропластиналық оқу құрылғысында (Mithras LB940) алынды.
DEET әсерлері in vitro ангиогенез талдаулары арқылы зерттелді. 10-8 М немесе 10-5 М DEET өңдеу HUVEC-де капиллярлық ұзындықтың түзілуін арттырды (сурет 1a, b, ақ жолақтар). Бақылау тобымен салыстырғанда, 10-14-тен 10-5 М-ге дейінгі DEET концентрацияларымен өңдеу капиллярлардың ұзындығы 10-8 М DEET-те платоға жеткенін көрсетті (қосымша S2 сурет). 10-8 М және 10-5 М концентрация диапазонында DEET-пен өңделген HUVEC-тердің in vitro проангиогендік әсерінде айтарлықтай айырмашылық табылған жоқ.
DEET неоваскуляризацияға әсерін анықтау үшін біз in vivo неоваскуляризация зерттеулерін жүргіздік. 14 күннен кейін 10-8 М немесе 10-5 М DEET алдын ала культураланған эндотелий жасушаларын енгізген тышқандар гемоглобин мөлшерінің айтарлықтай жоғарылауын көрсетті (1c-сурет, ақ жолақтар).
Бұдан басқа, DEET-индукцияланған неоваскуляризация U87MG ксеногрансплантаттары бар тышқандарда зерттелді, олар 10-5 М плазмалық концентрацияларды индукциялайтын белгілі дозада DEET күнделікті (ip) енгізілді, бұл әсерге ұшыраған адамдарда қалыпты жағдай. 23. Анықталатын ісіктер (яғни >100 мм3 ісіктер) тышқандарға U87MG жасушаларын енгізгеннен кейін 14 күннен кейін байқалды. 28-ші күні DEET-мен өңделген тышқандарда ісіктің өсуі бақылау тышқандарымен салыстырғанда айтарлықтай жақсарды (1d-сурет, квадраттар). Сонымен қатар, ісіктерді CD31 бояуы DEET капиллярлық аймақты айтарлықтай арттырғанын, бірақ микротамырлардың тығыздығын емес екенін көрсетті. (Cурет 1e–g).
DETA-индукцияланған пролиферациядағы мускариндік рецепторлардың рөлін анықтау үшін pFHHSiD (10-7 М, селективті M3 рецепторларының антагонисті) қатысуымен 10-8 М немесе 10-5 М DETA пайдаланылды. HUVEC емдеу. pFHHSiD барлық концентрацияларда DETA пролиферативті қасиеттерін толығымен блоктады (1-кесте).
Осы жағдайларда біз DEET HUVEC жасушаларында капиллярлардың ұзындығын арттыра ма, жоқ па, соны зерттедік. Сол сияқты, pFHHSiD DEET-индукцияланған капиллярлық ұзындыққа айтарлықтай кедергі келтірді (сурет 1a, b, сұр жолақтар). Сонымен қатар, ұқсас эксперименттер M3 siRNA-мен жасалды. Бақылау siRNA капиллярлардың түзілуіне ықпал етуде тиімді болмаса да, M3 мускариндік рецептордың дыбысын өшіру DEET-тің капиллярлардың ұзындығын ұлғайту мүмкіндігін жойды (сурет 1a, b, қара жолақтар).
Бұдан басқа, in vitro 10-8 М немесе 10-5 М DEET-индукцияланған васкуляризация да, in vivo неоваскуляризация да pFHHSiD арқылы толығымен бөгелді (сурет 1c, d, шеңберлер). Бұл нәтижелер DEET селективті M3 рецепторларының антагонистеріне немесе M3 siRNA-ға сезімтал жол арқылы ангиогенезге ықпал ететінін көрсетеді.
AChE DEET молекулалық нысанасы болып табылады. AChE тежегіштері ретінде әрекет ететін донепезил сияқты препараттар EC ангиогенезін in vitro және тышқанның артқы аяқтарының ишемия үлгілерінде ынталандыруы мүмкін14. Біз HUVEC-те DEET екі концентрациясының AChE ферментінің белсенділігіне әсерін тексердік. DEET төмен (10-8 М) және жоғары (10-5 М) концентрациясы бақылау жағдайларымен салыстырғанда эндотелийдің AChE белсенділігін төмендетті (2-сурет).
DEET концентрациясының екеуі де (10-8 М және 10-5 М) HUVEC-те ацетилхолинэстераза белсенділігін төмендетті. BW284c51 (10-5 М) ацетилхолинэстераза тежегіштерін бақылау ретінде пайдаланылды. Нәтижелер көлікпен өңделген жасушалармен салыстырғанда екі DEET концентрациясымен өңделген HUVEC жүйесіндегі AChE белсенділігінің пайызы ретінде көрсетіледі. Мәндер алты тәуелсіз эксперименттің орташа ± SEM ретінде көрсетіледі. *p < 0,05 бақылаумен салыстырғанда (Крускал-Уоллис және Даннның бірнеше салыстыру сынағы).
Азот оксиді (NO) ангиогендік процеске 33 қатысады, сондықтан DEET-стимуляцияланған HUVEC-де NO өндірісі зерттелді. DEET өңделген эндотелиальды NO өндірісі бақылау жасушаларымен салыстырғанда жоғарылады, бірақ маңыздылыққа 10-8 М дозада ғана жетті (3c-сурет). DEET-индукцияланған NO өндірісін бақылайтын молекулалық өзгерістерді анықтау үшін eNOS экспрессиясы және активтенуі Western blotting арқылы талданды. DEET өңдеу eNOS экспрессиясын өзгертпесе де, eNOS фосфорлануындағы өңделмеген жасушалармен салыстырғанда оның белсендіру орнында (Ser-1177) eNOS фосфорлануын айтарлықтай арттырды, сонымен бірге оның тежеу аймағын (Thr-495) азайтты (3d-сурет). Сонымен қатар, фосфорланған eNOS активтену орны мен тежеу орнындағы қатынасы фосфорланған eNOS мөлшерін ферменттің жалпы мөлшеріне қалыпқа келтіргеннен кейін есептелді. Бұл арақатынас өңделмеген жасушалармен салыстырғанда DEET әрбір концентрациясымен өңделген HUVEC-де айтарлықтай өсті (3d-сурет).
Соңында, негізгі проангиогендік факторлардың бірі болып табылатын VEGF экспрессиясы Western blotting әдісімен талданды. DEET VEGF өрнегін айтарлықтай арттырды, ал pFHHSiD бұл өрнекті толығымен блоктады.
DEET әсері фармакологиялық блокадаға да, M3 рецепторларының төмендеуіне де сезімтал болғандықтан, біз DEET кальций сигналын күшейтуі мүмкін деген гипотезаны тексердік. Бір таңқаларлығы, DEET HUVEC (деректер көрсетілмеген) және HEK/M3 (сурет 4a, b) цитоплазмалық кальцийді пайдаланылған екі концентрация үшін де арттыра алмады.
Жіберу уақыты: 30 желтоқсан 2024 ж