Бұл зерттеуде біріктірілген емдеудің ынталандырушы әсерлеріөсімдік өсу реттегіштері(2,4-D және кинетин) және темір оксиді нанобөлшектерінің (Fe₃O₄-NPs) *Hypericum perforatum* L. өсімдігінде in vitro морфогенез және екінші реттік метаболит өндірісі бойынша зерттелді. Оңтайландырылған емдеу [2,4-D (0,5 мг/л) + кинетин (2 мг/л) + Fe₃O₄-NPs (4 мг/л)] өсімдіктің өсу параметрлерін айтарлықтай жақсартты: бақылау тобымен салыстырғанда өсімдіктің биіктігі 59,6%-ға, тамыр ұзындығы 114,0%-ға, бүршік саны 180,0%-ға және каллустың жаңа салмағы 198,3%-ға өсті. Бұл біріктірілген емдеу сонымен қатар регенерация тиімділігін (50,85%) арттырды және гиперицин мөлшерін 66,6%-ға арттырды. GC-MS талдауы гиперозидтің, β-патолиннің және цетил спиртінің жоғары мөлшерін анықтады, бұл жалпы шың ауданының 93,36%-ын құрайды, ал фенолдар мен флавоноидтардың жалпы мөлшері 80,1%-ға дейін артты. Бұл нәтижелер өсімдіктердің өсуін реттегіштер (PGR) және Fe₃O₄ нанобөлшектері (Fe₃O₄-NPs) органогенезді және биоактивті қосылыстардың жиналуын ынталандыру арқылы синергетикалық әсер ететінін көрсетеді, бұл дәрілік өсімдіктерді биотехнологиялық жетілдірудің перспективалы стратегиясын білдіреді.
Шайқурай (Hypericum perforatum L.), сондай-ақ Шайқурай деп те аталады, Hypericaceae тұқымдасына жататын және экономикалық құндылығы бар көпжылдық шөптесін өсімдік.[1] Оның әлеуетті биоактивті компоненттеріне табиғи таниндер, ксантондар, флороглюцинол, нафталиндиантрон (гиперин және псевдогиперин), флавоноидтар, фенол қышқылдары және эфир майлары жатады.[2,3,4] Шайқурайды дәстүрлі әдістермен көбейтуге болады; дегенмен, дәстүрлі әдістердің маусымдылығы, тұқымның төмен өнуі және ауруларға бейімділігі оның кең көлемде өсіру және екінші реттік метаболиттердің үздіксіз түзілуі мүмкіндігін шектейді.[1,5,6]
Осылайша, in vitro тіндерді өсіру өсімдіктердің тез көбеюі, гермоплазма ресурстарын сақтау және дәрілік қосылыстардың өнімділігін арттырудың тиімді әдісі болып саналады [7, 8]. Өсімдіктердің өсуін реттегіштер (PGR) морфогенезді реттеуде маңызды рөл атқарады және каллусты және тұтас организмдерді in vitro өсіру үшін қажет. Олардың концентрациясы мен комбинацияларын оңтайландыру осы даму процестерін сәтті аяқтау үшін өте маңызды [9]. Сондықтан, реттегіштердің тиісті құрамы мен концентрациясын түсіну шайқурайдың (H. perforatum) өсуін және қалпына келтіру қабілетін жақсарту үшін маңызды [10].
Темір оксидінің нанобөлшектері (Fe₃O₄) - тіндерді өсіру үшін жасалған немесе жасалып жатқан нанобөлшектер класы. Fe₃O₄ айтарлықтай магниттік қасиеттерге, жақсы биоүйлесімділікке және өсімдіктердің өсуін ынталандыруға және қоршаған ортаға түсетін стрессті азайтуға қабілетті, сондықтан ол тіндерді өсіру дизайнында айтарлықтай назар аударды. Бұл нанобөлшектерді қолданудың әлеуетті бағыттарына жасушалардың бөлінуін ынталандыру, қоректік заттардың сіңуін жақсарту және антиоксидантты ферменттерді белсендіру үшін in vitro өсіруді оңтайландыру кіруі мүмкін [11].
Нанобөлшектер өсімдіктердің өсуіне жақсы әсер еткенімен, Fe₃O₄ нанобөлшектерін және *H. perforatum* өсімдіктерінің өсуін реттегіштерді бірлесіп қолдану бойынша зерттеулер әлі де аз. Бұл білім алшақтығын толтыру үшін бұл зерттеу дәрілік өсімдіктердің сипаттамаларын жақсарту үшін жаңа түсініктер беру мақсатында олардың in vitro морфогенезі мен екінші реттік метаболит өндірісіне бірлескен әсерінің әсерін бағалады. Сондықтан, бұл зерттеудің екі мақсаты бар: (1) каллус түзілуін, өскіндердің регенерациясын және тамырлануын in vitro тиімді түрде ынталандыру үшін өсімдіктердің өсуін реттегіштердің концентрациясын оңтайландыру; және (2) Fe₃O₄ нанобөлшектерінің өсу параметрлеріне in vitro әсерін бағалау. Болашақ жоспарларға акклиматизация кезінде (in vitro) қалпына келтірілген өсімдіктердің өмір сүру деңгейін бағалау кіреді. Бұл зерттеудің нәтижелері *H. perforatum* микрокөбею тиімділігін айтарлықтай жақсартады, осылайша бұл маңызды дәрілік өсімдікті тұрақты пайдалануға және биотехнологиялық қолдануға ықпал етеді деп күтілуде.
Бұл зерттеуде біз далада өсірілген біржылдық шайқурай өсімдіктерінен (ана өсімдіктерінен) жапырақ экспланттарын алдық. Бұл экспланттар in vitro өсіру жағдайларын оңтайландыру үшін пайдаланылды. Өсіру алдында жапырақтар бірнеше минут бойы ағынды дистилденген сумен мұқият шайылды. Содан кейін эксплант беттері 70% этанолға 30 секунд батыру арқылы зарарсыздандырылды, содан кейін Tween 20 бірнеше тамшысы бар 1,5% натрий гипохлориті (NaOCl) ерітіндісіне 10 минут батырылды. Соңында, келесі өсіру ортасына ауыстырмас бұрын экспланттар үш рет стерильді дистилденген сумен шайылды.
Келесі төрт апта ішінде өскіндердің регенерация параметрлері өлшенді, оның ішінде регенерация жылдамдығы, бір экспланттағы өскіндер саны және өскін ұзындығы. Регенерацияланған өскіндер ұзындығы кем дегенде 2 см-ге жеткенде, олар жартылай берік MS ортасынан, 0,5 мг/л индолмай қышқылынан (IBA) және 0,3% гуар шайырынан тұратын тамырландыру ортасына ауыстырылды. Тамырландыру үш апта бойы жалғасты, осы уақыт ішінде тамырландыру жылдамдығы, тамыр саны және тамыр ұзындығы өлшенді. Әрбір өңдеу үш рет қайталанды, әр қайталауда 10 эксплант өсірілді, бұл емдеуде шамамен 30 эксплант берді.
Өсімдіктің биіктігі сызғышты пайдаланып, өсімдіктің түбінен ең биік жапырақтың ұшына дейін сантиметрмен (см) өлшенді. Тамыр ұзындығы көшеттерді мұқият алып тастағаннан және өсу ортасын алып тастағаннан кейін бірден миллиметрмен (мм) өлшенді. Әрбір эксплантациядағы бүршіктердің саны әрбір өсімдікте тікелей есептелді. Жапырақтағы қара дақтардың саны, түйіндер деп аталатын, көзбен өлшенді. Бұл қара түйіндер гиперицин немесе тотығу дақтары бар бездер деп есептеледі және өсімдіктің емдеуге реакциясының физиологиялық көрсеткіші ретінде қолданылады. Барлық өсу ортасын алып тастағаннан кейін, көшеттердің жаңа салмағы миллиграмм (мг) дәлдікпен электронды таразы арқылы өлшенді.
Каллус түзілу жылдамдығын есептеу әдісі келесідей: экспланттарды әртүрлі өсу реттегіштері (киназалар, 2,4-D және Fe3O4) бар ортада төрт апта бойы өсіргеннен кейін, каллус түзе алатын экспланттар саны есептеледі. Каллус түзілу жылдамдығын есептеу формуласы келесідей:
Әрбір емдеу үш рет қайталанды, әр қайталауда кемінде 10 эксплант тексерілді.
Регенерация жылдамдығы каллус түзілу кезеңінен кейін бүршік дифференциациясы процесін сәтті аяқтаған каллус тінінің үлесін көрсетеді. Бұл көрсеткіш каллус тінінің дифференциацияланған тінге айналу және жаңа өсімдік мүшелеріне айналу қабілетін көрсетеді.
Тамырлану коэффициенті - тамырлануға қабілетті бұтақтар санының жалпы бұтақтар санына қатынасы. Бұл көрсеткіш тамырлану кезеңінің сәттілігін көрсетеді, бұл микрокөбеюде және өсімдіктердің көбеюінде өте маңызды, себебі жақсы тамырлану көшеттердің өсу жағдайларында жақсы тіршілік етуіне көмектеседі.
Гиперицин қосылыстары 90% метанолмен экстракцияланды. 1 мл метанолға елу мг кептірілген өсімдік материалы қосылып, бөлме температурасында қараңғыда ультрадыбыстық тазартқышта (A5120-3YJ моделі) 30 кГц жиілікте 20 минут бойы ультрадыбыстық өңдеуден өтті. Ультрадыбыстық өңдеуден кейін үлгі 15 минут бойы 6000 айн/мин жылдамдықпен центрифугаланды. Супернатант жиналды, ал гиперициннің абсорбциясы Консейсао және т.б. [14] сипаттаған әдіске сәйкес Plus-3000 S спектрофотометрін пайдаланып 592 нм толқын ұзындығында өлшенді.
Өсімдіктердің өсуін реттегіштермен (PGR) және темір оксиді нанобөлшектерімен (Fe₃O₄-NPs) емдеудің көпшілігі қалпына келтірілген өскін жапырақтарында қара түйіндердің пайда болуын тудырмады. 0,5 немесе 1 мг/л 2,4-D, 0,5 немесе 1 мг/л кинетинмен немесе 1, 2 немесе 4 мг/л темір оксиді нанобөлшектерімен емдеудің ешқайсысында түйіндер байқалмады. Кинетиннің және/немесе темір оксиді нанобөлшектерінің жоғары концентрацияларында бірнеше комбинация түйіндердің дамуының аздап артуын көрсетті (бірақ статистикалық тұрғыдан маңызды емес), мысалы, 2,4-D (0,5-2 мг/л) кинетинмен (1-1,5 мг/л) және темір оксиді нанобөлшектерімен (2-4 мг/л) үйлесімі. Бұл нәтижелер 2-суретте көрсетілген. Қара түйіндер табиғи түрде кездесетін және пайдалы гиперицинге бай бездерді білдіреді. Бұл зерттеуде қара түйіндер негізінен тіндердің қоңырлануымен байланысты болды, бұл гиперициннің жиналуына қолайлы ортаны көрсетеді. 2,4-D, кинетин және Fe₃O₄ нанобөлшектерімен емдеу каллустың өсуіне, қоңырланудың төмендеуіне және хлорофилл мөлшерінің артуына ықпал етті, бұл метаболикалық функцияның жақсарғанын және тотығу зақымының ықтимал төмендеуін көрсетеді [37]. Бұл зерттеу кинетиннің 2,4-D және Fe₃O₄ нанобөлшектерімен бірге шайқурай каллусының өсуі мен дамуына әсерін бағалады (3a–g сурет). Алдыңғы зерттеулер Fe₃O₄ нанобөлшектерінің зеңге қарсы және микробқа қарсы белсенділігі бар екенін көрсетті [38, 39] және өсімдіктердің өсуін реттегіштермен бірге қолданған кезде өсімдіктердің қорғаныс механизмдерін ынталандырып, жасушалық стресс көрсеткіштерін төмендете алады [18]. Екінші реттік метаболиттердің биосинтезі генетикалық тұрғыдан реттелсе де, олардың нақты өнімділігі қоршаған орта жағдайларына өте тәуелді. Метаболикалық және морфологиялық өзгерістер белгілі бір өсімдік гендерінің экспрессиясын реттеу және қоршаған орта факторларына жауап беру арқылы екінші реттік метаболит деңгейіне әсер етуі мүмкін. Сонымен қатар, индукторлар жаңа гендердің белсенділігін тудыруы мүмкін, бұл өз кезегінде ферментативті белсенділікті ынталандырады, сайып келгенде бірнеше биосинтетикалық жолдарды белсендіреді және екінші реттік метаболиттердің түзілуіне әкеледі. Сонымен қатар, тағы бір зерттеу көлеңкелеуді азайту күн сәулесінің әсерін арттыратынын, осылайша *Hypericum perforatum* табиғи мекендеу ортасында күндізгі температураны көтеретінін, бұл гиперицин өнімділігінің артуына ықпал ететінін көрсетті. Осы деректерге сүйене отырып, бұл зерттеу темір нанобөлшектерінің тін дақылындағы әлеуетті индукторлар ретіндегі рөлін зерттеді. Нәтижелер бұл нанобөлшектер ферментативті ынталандыру арқылы гесперидин биосинтезіне қатысатын гендерді белсендіре алатынын, бұл қосылыстың жиналуының артуына әкелетінін көрсетті (2-сурет). Сондықтан, табиғи жағдайда өсетін өсімдіктермен салыстырғанда, орташа стресс екінші реттік метаболиттердің биосинтезіне қатысатын гендердің белсенділігімен біріктірілгенде, мұндай қосылыстардың in vivo өндірісін де арттыруға болады деп айтуға болады. Біріктірілген емдеу әдетте регенерация жылдамдығына оң әсер етеді, бірақ кейбір жағдайларда бұл әсер әлсірейді. Атап айтқанда, 1 мг/л 2,4-D, 1,5 мг/л киназа және әртүрлі концентрациялармен емдеу бақылау тобымен салыстырғанда регенерация жылдамдығын тәуелсіз және айтарлықтай 50,85%-ға арттыра алады (4c-сурет). Бұл нәтижелер наногормондардың нақты комбинациялары өсімдіктердің өсуі мен метаболиттердің өндірілуін ынталандыру үшін синергетикалық әсер ете алатынын көрсетеді, бұл дәрілік өсімдіктердің тіндерін өсіру үшін үлкен маңызға ие. Палмер мен Келлер [50] 2,4-D емдеу St. perforatum-да каллустың түзілуін тәуелсіз түрде тудыруы мүмкін екенін, ал киназаны қосу каллустың түзілуі мен регенерациясын айтарлықтай жақсартатынын көрсетті. Бұл әсер гормоналды тепе-теңдіктің жақсаруына және жасуша бөлінуінің ынталандырылуына байланысты болды. Бал және т.б. [51] Fe₃O₄-NP емдеу антиоксидантты ферменттердің қызметін тәуелсіз түрде күшейте алатынын, осылайша St. perforatum-да тамырдың өсуін ынталандыратынын анықтады. 0,5 мг/л, 1 мг/л және 1,5 мг/л концентрациясындағы Fe₃O₄ нанобөлшектерін қамтитын қоректік орталар зығыр өсімдіктерінің регенерация жылдамдығын жақсартты [52]. Кинетинді, 2,4-дихлорбензотиазолинонды және Fe₃O₄ нанобөлшектерін қолдану каллус пен тамырдың түзілу жылдамдығын айтарлықтай жақсартты, дегенмен, бұл гормондарды in vitro регенерация үшін қолданудың ықтимал жанама әсерлерін ескеру қажет. Мысалы, 2,4-дихлорбензотиазолинонды немесе кинетинді ұзақ мерзімді немесе жоғары концентрацияда қолдану соматикалық клондық вариацияға, тотығу стрессіне, каллустың қалыптан тыс морфологиясына немесе шыныдануға әкелуі мүмкін. Сондықтан, жоғары регенерация жылдамдығы міндетті түрде генетикалық тұрақтылықты болжай бермейді. Барлық регенерацияланған өсімдіктерді молекулалық маркерлерді (мысалы, RAPD, ISSR, AFLP) немесе цитогенетикалық талдауды пайдаланып бағалау керек, олардың біртектілігі мен in vivo өсімдіктерге ұқсастығын анықтау керек [53,54,55].
Бұл зерттеу алғаш рет өсімдіктердің өсу реттегіштерін (2,4-D және кинетин) Fe₃O₄ нанобөлшектерімен бірге қолдану морфогенезді және *Hypericum perforatum* өсімдігінде негізгі биоактивті метаболиттердің (гиперицин мен гиперозидті қоса алғанда) жиналуын жақсарта алатынын көрсетті. Оңтайландырылған емдеу режимі (1 мг/л 2,4-D + 1 мг/л кинетин + 4 мг/л Fe₃O₄-NPs) каллус түзілуін, органогенезді және екінші реттік метаболиттердің шығымын барынша арттырып қана қоймай, сонымен қатар өсімдіктің стресске төзімділігін және дәрілік құндылығын арттыратын жұмсақ индукциялық әсерді көрсетті. Нанотехнология мен өсімдік тіндерінің дақылының үйлесімі дәрілік қосылыстардың in vitro кең көлемді өндірісі үшін тұрақты және тиімді платформаны қамтамасыз етеді. Бұл нәтижелер өнеркәсіптік қолдану және молекулалық механизмдерді, дозаны оңтайландыруды және генетикалық дәлдікті зерттеу бойынша болашақ зерттеулерге жол ашады, осылайша дәрілік өсімдіктер бойынша іргелі зерттеулерді практикалық биотехнологиямен байланыстырады.
Жарияланған уақыты: 2025 жылғы 12 желтоқсан