Өскіннің апикальды меристемасының (SAM) өсуі дің архитектурасы үшін өте маңызды. Өсімдік гормондарыгиббереллиндер(ГА) өсімдіктердің өсуін үйлестіруде негізгі рөлдерді атқарады, бірақ олардың SAM-дағы рөлі әлі де аз зерттелген. Мұнда біз DELLA протеинін GA тану кезінде оның деградациясын сақтай отырып, GA транскрипциялық жауапта оның маңызды реттеуші функциясын басу үшін инженерлік жолмен GA сигналының рационалдық биосенсорын жасадық. Біз бұл деградацияға негізделген биосенсор GA деңгейлеріндегі өзгерістерді және даму кезінде жасушалық сезінуді дәл тіркейтінін көрсетеміз. Біз бұл биосенсорды SAM жүйесіндегі GA сигналдық белсенділігін картаға түсіру үшін қолдандық. Біз жоғары GA сигналдары негізінен түйінаралық жасушалардың прекурсорлары болып табылатын орган примордиялары арасында орналасқан жасушаларда болатынын көрсетеміз. Функцияның пайда болу және жоғалту тәсілдерін пайдалана отырып, біз GA жасуша бөліну жазықтығының бағдарын реттейтінін, түйін аралықтардың канондық жасушалық ұйымын орнататынын, осылайша SAM-да түйінаралық спецификацияға ықпал ететінін көрсетеміз.
Өсімдіктің төбесінде орналасқан өркеннің апикальды меристемасы (SAM) дің жасушаларының ұясын қамтиды, олардың қызметі өсімдіктің бүкіл өмірінде модульдік және итеративті түрде бүйірлік мүшелер мен өзек түйіндерін жасайды. Осы қайталанатын бірліктердің немесе өсімдік түйіндерінің әрқайсысына түйіндердегі түйін аралық және бүйірлік мүшелер, жапырақ қолтығындағы қолтық асты меристемалары1 кіреді. Өсімдік түйіндерінің өсуі мен ұйымдастырылуы даму барысында өзгереді. Арабидопсисте вегетативтік кезеңде түйін аралық өсу басылады, ал розетка жапырақтарының қолтығында қолтық асты меристемалары ұйықтап қалады. Флоралық фазаға өту кезінде САМ гүлшоғыры меристемаға айналады, ұзартылған түйін аралық және қолтық асты бүршіктері, каулин жапырақтарының қолтығында бұтақшалар, кейінірек жапырақсыз гүлдер пайда болады2. Жапырақтардың, гүлдердің және бұтақтардың инициациясын бақылайтын механизмдерді түсінуде айтарлықтай прогреске қол жеткізгенімізге қарамастан, интернодтардың қалай пайда болатыны туралы салыстырмалы түрде аз белгілі.
ГА-ның кеңістік-уақытша таралуын түсіну бұл гормондардың әртүрлі ұлпалардағы және әртүрлі даму кезеңдеріндегі функцияларын жақсы түсінуге көмектеседі. RGA-GFP синтезінің ыдырауының визуализациясы өз промоутерінің әсерінен көрінеді. Дегенмен, RGA экспрессиясы тіндерде өзгереді17 және GA18 арқылы реттеледі. Осылайша, RGA промоторының дифференциалды көрінісі RGA-GFP көмегімен байқалатын флуоресценция үлгісіне әкелуі мүмкін, сондықтан бұл әдіс сандық емес. Жақында биоактивті флуоресцеин (Fl) таңбаланған GA19,20 түбірлік эндокортексте ГА жинақталуын және ГА тасымалдау арқылы оның жасушалық деңгейлерінің реттелуін анықтады. Жақында GA FRET сенсоры nlsGPS1 GA деңгейлері тамырлардағы, жіптердегі және қара түсті гипокотилдердегі жасушалардың ұзаруымен корреляцияланғанын көрсетті21. Дегенмен, біз көріп отырғанымыздай, GA концентрациясы GA сигнал беру белсенділігін басқаратын жалғыз параметр емес, өйткені ол күрделі сезу процестеріне байланысты. Мұнда DELLA және GA сигнал беру жолдары туралы түсінігімізге сүйене отырып, біз GA сигнализациясы үшін деградацияға негізделген коэффициенттік биосенсордың дамуы мен сипаттамасы туралы хабарлаймыз. Осы сандық биосенсорды жасау үшін біз флуоресцентті ақуызға біріктірілген және тіндерде барлық жерде экспрессияланған мутантты GA-сезімтал RGA, сондай-ақ GA-сезімсіз флуоресцентті ақуызды қолдандық. Біз мутант RGA протеинінің синтезі барлық жерде экспрессияланған кезде эндогендік GA сигнализациясына кедергі жасамайтынын және бұл биосенсордың кеңістіктік-уақыттық ажыратымдылығы жоғары сенсорлық аппараттың GA кірісі мен GA сигналын өңдеуінің нәтижесінде туындайтын сигналдық белсенділікті сандық түрде анықтай алатынын көрсетеміз. Біз бұл биосенсорды GA сигналдық белсенділігінің кеңістіктік-уақыттық таралуын картаға түсіру және GA SAM эпидермисіндегі жасушалық әрекетті қалай реттейтінін сандық анықтау үшін қолдандық. Біз GA орган примордиялары арасында орналасқан SAM жасушаларының бөліну жазықтығының бағдарын реттейтінін көрсетеміз, осылайша түйін аралық жасушаның канондық ұйымын анықтайды.
Соңында біз qmRGA өсіп келе жатқан гипокотилдерді пайдалана отырып, эндогендік GA деңгейлеріндегі өзгерістер туралы хабарлай алатынын сұрадық. Біз бұған дейін нитраттың GA синтезін жоғарылату және өз кезегінде DELLA34 ыдырауы арқылы өсуді ынталандыратынын көрсеттік. Тиісінше, нитраттардың мол қорымен (10 мМ NO3−) өсірілген pUBQ10 :: qmRGA көшеттеріндегі гипокотил ұзындығы нитрат тапшылығы жағдайында өсірілген көшеттерге қарағанда айтарлықтай ұзағырақ екенін байқадық (қосымша сурет 6a). Өсу реакциясына сәйкес GA сигналдары нитраты жоқ жерде өсірілген көшеттерге қарағанда 10 мМ NO3− жағдайында өсірілген көшеттердің гипокотилдерінде жоғары болды (Қосымша 6b, c сурет). Осылайша, qmRGA сонымен қатар GA концентрациясының эндогендік өзгерістерінен туындаған GA сигналындағы өзгерістерді бақылауға мүмкіндік береді.
QmRGA арқылы анықталған GA сигналдық белсенділігі сенсор дизайны негізінде күтілгендей GA концентрациясына және GA қабылдауына тәуелді екенін түсіну үшін біз вегетативті және репродуктивті тіндердегі үш GID1 рецепторларының экспрессиясын талдадық. Көшеттерде GID1-GUS репортер сызығы GID1a және c котиледондарда жоғары экспрессияланғанын көрсетті (3a–c-сурет). Сонымен қатар, барлық үш рецепторлар жапырақтарда, бүйірлік тамыр примордиясында, тамыр ұштарында (GID1b тамыр қалпақшасынан басқа) және тамырлар жүйесінде (3a-c-сурет) көрсетілген. SAM гүлшоғырында біз тек GID1b және 1c үшін GUS сигналдарын анықтадық (Қосымша 7a–c сурет). In situ будандастыру осы өрнек үлгілерін растады және одан әрі GID1c SAM-де төмен деңгейлерде біркелкі экспрессияланғанын көрсетті, ал GID1b SAM шетінде жоғары өрнек көрсетті (Қосымша 7d-l сурет). pGID1b :: 2xmTQ2-GID1b трансляциялық синтезі сонымен қатар SAM орталығында төмен немесе жоқ өрнектен орган шекараларындағы жоғары экспрессияға дейін GID1b өрнектің деңгейлі диапазонын анықтады (Қосымша сурет 7m). Осылайша, GID1 рецепторлары ұлпалар арасында және ішінде біркелкі таралмайды. Кейінгі эксперименттерде біз GID1 (pUBQ10 :: GID1a-mCherry) шамадан тыс экспрессиясы гипокотилдерде qmRGA сезімталдығын сыртқы GA қолданбасына арттырғанын байқадық (3d, e-сурет). Керісінше, гипокотилдегі qd17mRGA арқылы өлшенген флуоресценция GA3 өңдеуіне сезімтал емес болды (3f, g-сурет). Екі талдау үшін де GID1 рецепторымен байланысу мүмкіндігі жоғарылаған немесе жоғалған сенсордың жылдам әрекетін бағалау үшін көшеттер GA жоғары концентрациясымен (100 мкм GA3) өңделген. Бұл нәтижелер бірге qmRGA биосенсорының GA және GA сенсоры ретінде біріктірілген функцияны атқаратынын растайды және GID1 рецепторының дифференциалды экспрессиясы сенсордың сәуле шығару қабілетін айтарлықтай модуляциялай алады деп болжайды.
Бүгінгі күні SAM-да GA сигналдарының таралуы түсініксіз болып қалады. Сондықтан, L1 қабатына (эпидермис; 4a, b суреті, Әдістер мен қосымша әдістерді қараңыз) назар аудара отырып, GA сигнал беру белсенділігінің жоғары ажыратымдылықтағы сандық карталарын есептеу үшін qmRGA-экспрессиялайтын өсімдіктер мен pCLV3::mCherry-NLS дің жасушаларының репортерін35 қолдандық. Мұнда pCLV3::mCherry-NLS өрнегі GA сигнал беру белсенділігінің кеңістік-уақытша таралуын талдау үшін бекітілген геометриялық анықтамалық нүктені қамтамасыз етті37. GA бүйірлік органның дамуы үшін маңызды деп саналғанымен4, біз GA сигналдарының P3 сатысынан бастап гүлді примордиумда (P) төмен болғанын байқадық (4а, б-сурет), ал жас P1 және P2 примордиумдары орталық аймақтағыға ұқсас қалыпты белсенділікке ие болды (4а, б-сурет). Жоғары GA сигналдық белсенділігі органның примордиум шекараларында, P1/P2-ден (шекараның бүйірлерінде) басталып, P4-те шыңына дейін, сондай-ақ примордия арасында орналасқан шеткергі аймақтың барлық жасушаларында анықталды (4a, b-сурет және Қосымша 8a, b сурет). Бұл жоғары GA сигналдық белсенділігі эпидермисте ғана емес, сонымен қатар L2 және жоғарғы L3 қабаттарында да байқалды (Қосымша 8b-сурет). SAM жүйесінде qmRGA көмегімен анықталған GA сигналдарының үлгісі де уақыт өте өзгеріссіз қалды (Қосымша 8c-f, k-сурет). Qd17mRGA құрылымы T3 зауыттарының SAM жүйесінде біз егжей-тегжейлі сипаттаған бес тәуелсіз сызықтан жүйелі түрде төмендетілгенімен, біз pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP конструкциясымен алынған флуоресценция үлгілерін талдай алдық (Қосымша сурет 8g-j, l). Бұл бақылау сызығында SAM-да флуоресценция қатынасындағы шамалы өзгерістер ғана анықталды, бірақ SAM орталығында біз TagBFP-мен байланысты VENUS-тың анық және күтпеген төмендеуін байқадық. Бұл qmRGA бақылаған сигнал беру үлгісі mRGA-VENUS-тың GA-тәуелді деградациясын көрсететінін растайды, сонымен қатар qmRGA меристема орталығындағы GA сигналдық белсенділігін асыра бағалауы мүмкін екенін көрсетеді. Қорытындылай келе, біздің нәтижелеріміз бірінші кезекте примордианың таралуын көрсететін GA сигналының үлгісін көрсетеді. Алғашқы аймақтың (IPR) бұлай таралуы дамып келе жатқан примордиум мен орталық аймақ арасында жоғары ГА сигналдық белсенділігінің бірте-бірте орнатылуымен түсіндіріледі, бұл кезде примордиумдағы ГА сигналдық белсенділігі төмендейді (4в, г-сурет).
GID1b және GID1c рецепторларының таралуы (жоғарыдан қараңыз) GA рецепторларының дифференциалды экспрессиясы SAM-дағы GA сигналдық белсенділігінің үлгісін қалыптастыруға көмектесетінін көрсетеді. Біз GA дифференциалды жинақталуына қатысты болуы мүмкін бе деп ойладық. Бұл мүмкіндікті зерттеу үшін біз nlsGPS1 GA FRET сенсорын21 қолдандық. 100 минут бойы 10 мкМ GA4+7 өңделген nlsGPS1 SAM-де белсендіру жиілігінің жоғарылауы анықталды (Қосымша 9a–e сурет), бұл nlsGPS1 тамырлардағы сияқты SAM-дағы GA концентрациясының өзгеруіне жауап беретінін көрсетеді21. nlsGPS1 белсендіру жиілігінің кеңістікте таралуы SAM сыртқы қабаттарында салыстырмалы түрде төмен GA деңгейлерін анықтады, бірақ олардың SAM ортасында және шекараларында жоғарылағанын көрсетті (4e-сурет және Қосымша 9a,c-сурет). Бұл GA сонымен қатар qmRGA анықтағанмен салыстырылатын кеңістіктік үлгімен SAM-де таратылатынын көрсетеді. Қосымша тәсіл ретінде біз сонымен қатар теріс бақылау ретінде тек флуоресцентті GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) немесе Fl бар SAM-ды қарастырдық. Fl сигналы төменгі қарқындылықпен болса да, орталық аймақ пен примордиумды қоса алғанда, SAM бойынша таратылды (4j-сурет және қосымша 10d-сурет). Керісінше, барлық үш GA-Fl арнайы бастапқы шекараларда және IPR-ның қалған бөлігінде әртүрлі дәрежеде жинақталған, GA7-Fl IPR-дағы ең үлкен доменде жинақталған (4к-сурет және Қосымша 10a,b-сурет). Флуоресценция қарқындылығын сандық анықтау IPR мен IPR емес қарқындылық арақатынасының GA-Fl өңделген SAM-да Fl-өңделген SAM-мен салыстырғанда жоғары екенін көрсетті (4l-сурет және Қосымша 10c-сурет). Бірге бұл нәтижелер орган шекарасына ең жақын орналасқан IPR жасушаларында ГА жоғары концентрацияда болатынын көрсетеді. Бұл SAM GA сигналдық белсенділігінің үлгісі ГА рецепторларының дифференциалды экспрессиясынан және орган шекараларына жақын IPR жасушаларында GA дифференциалды жинақталуынан туындайтынын көрсетеді. Осылайша, біздің талдауымыз ГА сигнализациясының күтпеген кеңістік-уақыттық үлгісін анықтады, SAM орталығы мен примордиумында төмен белсенділік және шеткергі аймақта IPR белсенділігі жоғары.
SAM жүйесіндегі дифференциалды GA сигналдық белсенділігінің рөлін түсіну үшін біз SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS нақты уақыттағы уақыт үзіліс кескінін пайдалана отырып, GA сигнал беру белсенділігі, жасушаның кеңеюі және жасушаның бөлінуі арасындағы корреляцияны талдадық. Өсуді реттеудегі ГА рөлін ескере отырып, жасушаның кеңею параметрлерімен оң корреляция күтілді. Сондықтан, біз алдымен GA сигналдық белсенділік карталарын жасуша бетінің өсу жылдамдығының карталарымен (берілген жасуша үшін және бөліну кезіндегі жасуша кеңеюінің күші үшін прокси ретінде) және жасуша кеңеюінің бағыттылығын өлшейтін өсу анизотропиясының карталарымен салыстырдық (сонымен бірге бұл жерде берілген ұяшық үшін және бөліну кезіндегі еншілес жасушалар үшін қолданылады; Әдіс, 5-сурет және қосымшаларды қараңыз). Біздің SAM жасушаларының бетінің өсу жылдамдығының карталары алдыңғы бақылауларға сәйкес келеді38,39, шекарадағы минималды өсу қарқыны және дамып келе жатқан гүлдердегі максималды өсу қарқыны (5а-сурет). Негізгі компоненттерді талдау (PCA) GA сигналдық белсенділігі жасуша бетінің өсу қарқындылығымен теріс корреляцияланғанын көрсетті (5c-сурет). Біз сондай-ақ негізгі вариация осьтері, соның ішінде GA сигналдық кірісі мен өсу қарқындылығы жоғары CLV3 өрнегімен анықталған бағытқа ортогональды екенін көрсеттік, бұл қалған талдауларда SAM орталығынан жасушаларды алып тастауды растайды. Спирманның корреляциялық талдауы PCA нәтижелерін растады (5d-сурет), бұл IPR-дағы жоғары GA сигналдары жасушаның жоғары кеңеюіне әкелмейтінін көрсетеді. Дегенмен, корреляциялық талдау GA сигналдық белсенділігі мен өсу анизотропиясы арасындағы шамалы оң корреляцияны анықтады (5c, d-сурет), IPR-дағы жоғары GA сигнализациясы жасуша өсу бағытына және, мүмкін, жасушаның бөліну жазықтығының позициясына әсер етеді.
a, b SAM-дағы орташа беттік өсудің (a) және өсу анизотропиясының (b) жылу карталары жеті тәуелсіз өсімдіктерден (тиісінше жасуша кеңеюінің күші мен бағыты үшін прокси ретінде пайдаланылады). c PCA талдауы келесі айнымалыларды қамтиды: GA сигналы, беттік өсу қарқындылығы, беттік өсу анизотропиясы және CLV3 өрнегі. PCA 1 компоненті негізінен бетінің өсу қарқындылығымен теріс корреляцияланды және GA сигналымен оң корреляцияланды. PCA 2 компоненті негізінен беттік өсу анизотропиясымен оң корреляцияда және CLV3 өрнекімен теріс корреляцияда болды. Пайыздар әрбір құрамдаспен түсіндірілетін вариацияны білдіреді. d GA сигналы, беттік өсу қарқындылығы және CZ қоспағанда тін шкаласында беттік өсу анизотропиясы арасындағы Спирмен корреляциясының талдауы. Оң жақтағы сан екі айнымалы арасындағы Spearman rho мәні болып табылады. Жұлдызшалар корреляция/теріс корреляция өте маңызды болатын жағдайларды көрсетеді. e Col-0 SAM L1 жасушаларының конфокальды микроскопия арқылы 3D визуализациясы. 10 сағатта SAM-да (бірақ примордиумда емес) пайда болған жаңа жасуша қабырғалары олардың бұрыштық мәндеріне сәйкес боялады. Түс жолағы төменгі оң жақ бұрышта көрсетіледі. Кірістірілген 0 сағ сәйкес 3D кескінді көрсетеді. Ұқсас нәтижелермен эксперимент екі рет қайталанды. f Қорап сызбалары IPR және IPR емес Col-0 SAM (n = 10 тәуелсіз зауыт) жүйесінде жасушалардың бөліну жылдамдығын көрсетеді. Орталық сызық медиананы көрсетеді, ал қорап шекаралары 25-ші және 75-ші процентильдерді көрсетеді. Мұрттар R бағдарламалық құралымен анықталған ең төменгі және максималды мәндерді көрсетеді. P мәндері Уэлчтің екі жақты t-сынағы арқылы алынды. g, h (g) SAM ортасынан радиалды бағытқа (ақ нүктелі сызық) қатысты жаңа жасуша қабырғасының (қызыл түсті) бұрышын өлшеу әдісін көрсететін схемалық диаграмма (тек сүйір бұрыш мәндері, яғни 0–90° ескеріледі) және (h) меристема ішіндегі шеңберлік/бүйірлік және радиалды бағыттарды. i Сәйкесінше SAM (қара көк), IPR (орташа көк) және IPR емес (ашық көк) бойынша ұяшықтардың бөліну жазықтығы бағдарының жиілік гистограммалары. P мәндері екі жақты Колмогоров-Смирнов сынағы арқылы алынды. Ұқсас нәтижелермен эксперимент екі рет қайталанды. j Сәйкесінше P3 (ашық жасыл), P4 (орташа жасыл) және P5 (қою жасыл) айналасындағы IPR ұяшықтардың бөліну жазықтығы бағдарының жиілік гистограммалары. P мәндері екі жақты Колмогоров-Смирнов сынағы арқылы алынды. Ұқсас нәтижелермен эксперимент екі рет қайталанды.
Сондықтан біз талдау кезінде жаңадан пайда болған жасуша қабырғаларын анықтау арқылы GA сигнализациясы мен жасушаның бөліну белсенділігі арасындағы корреляцияны зерттедік (сурет 5e). Бұл тәсіл жасушаның бөліну жиілігі мен бағытын өлшеуге мүмкіндік берді. Бір таңқаларлығы, біз IPR және қалған SAM (IPR емес, 5f-сурет) жасушаларының бөліну жиілігі ұқсас болғанын анықтадық, бұл IPR және IPR емес жасушалар арасындағы GA сигналындағы айырмашылықтар жасушаның бөлінуіне айтарлықтай әсер етпейтінін көрсетеді. Бұл және GA сигнализациясы мен өсу анизотропиясы арасындағы оң корреляция бізді GA сигналдық белсенділігі жасушаның бөліну жазықтығының бағдарына әсер ете алатынын қарастыруға итермеледі. Біз жаңа жасуша қабырғасының бағдарын меристемалық орталық пен жаңа жасуша қабырғасының ортасын байланыстыратын радиалды оське қатысты өткір бұрыш ретінде өлшедік (сурет 5e-i) және жасушалардың радиалды оське қатысты 90 ° жақын бұрыштарда бөлінуінің айқын тенденциясын байқадық, ең жоғары жиіліктер 70-80 ° 8 және 70-80 ° (%)23.29 ° -де байқалды. (22,62%) (5e,i-сурет), айналмалы/көлденең бағыттағы жасушалардың бөлінулеріне сәйкес келеді (5h-сурет). GA сигналының жасушаның бөліну әрекетіне қосқан үлесін зерттеу үшін біз IPR және IPR емес жасушалардың бөліну параметрлерін бөлек талдадық (5i-сурет). Біз IPR жасушаларында бөліну бұрышының таралуы IPR емес жасушалардан немесе бүкіл SAM жасушаларындағыдан ерекшеленетінін байқадық, IPR жасушалары бүйірлік/айналмалы жасуша бөлінулерінің жоғары үлесін көрсетеді, яғни 70–80° және 80–90° (тиісінше 33.86% және 30.71%, Fig.5). Осылайша, біздің бақылауларымыз жоғары GA сигнализациясы мен GA сигналдық белсенділігі мен өсу анизотропиясы арасындағы корреляцияға ұқсас, айналмалы бағытқа жақын жасушаның бөліну жазықтығы бағдары арасындағы байланысты анықтады (Cурет 5c, d). Бұл қауымдастықтың кеңістіктік сақталуын одан әрі анықтау үшін біз P3-тен бастап примордиумды қоршап тұрған IPR жасушаларында бөлу жазықтығы бағдарын өлшедік, өйткені бұл аймақта P4-тен бастап ең жоғары GA сигналдық белсенділігі анықталды (4-сурет). Р3 және Р4 айналасындағы IPR бөліну бұрыштары статистикалық маңызды айырмашылықтарды көрсетпеді, дегенмен P4 айналасындағы IPR-да бүйірлік жасушалардың бөліну жиілігінің жоғарылауы байқалды (5j-сурет). Бірақ Р5 айналасындағы IPR жасушаларында жасушаның бөліну жазықтығының бағдарындағы айырмашылық статистикалық маңызды болды, көлденең жасушалардың бөліну жиілігі күрт артты (5j сурет). Бірге, бұл нәтижелер GA сигнализациясы SAM-дағы жасуша бөлімшелерінің бағдарын басқара алатынын көрсетеді, бұл жоғары GA сигнализациясы IPR-да жасуша бөлімшелерінің бүйірлік бағдарлануын тудыруы мүмкін деген алдыңғы есептер40,41 сәйкес келеді.
Болжам бойынша, IPR-дағы жасушалар примордияға емес, түйінаралықтарға қосылады2,42,43. IPR-да жасушалардың бөлінулерінің көлденең бағытталуы эпидермиялық жасушалардың параллель бойлық қатарларының түйін аралықтарында типтік ұйымдастырылуына әкелуі мүмкін. Жоғарыда сипатталған біздің бақылауларымыз GA сигнализациясы жасушаның бөліну бағытын реттеу арқылы осы процесте рөл атқаратынын көрсетеді.
Бірнеше DELLA гендерінің функциясының жоғалуы конститутивтік GA реакциясына әкеледі және бұл гипотезаны тексеру үшін делла мутанттары пайдаланылуы мүмкін44. Біз алдымен SAM-да бес DELLA генінің экспрессия үлгілерін талдадық. GUS сызығының45 транскрипциялық синтезі GAI, RGA, RGL1 және RGL2 (аз дәрежеде) SAM-де көрсетілгенін көрсетті (қосымша 11a–d сурет). In situ будандастыру одан әрі GAI мРНҚ-ның примордияда және дамып келе жатқан гүлдерде жинақталатынын көрсетті (Қосымша 11e-сурет). RGL1 және RGL3 мРНҚ бүкіл SAM шатырында және ескі гүлдерде анықталды, ал RGL2 мРНҚ шекаралық аймақта көбірек болды (қосымша 11f-h сурет). pRGL3 :: RGL3-GFP SAM конфокальды кескіні in situ будандастыру арқылы байқалған өрнекті растады және RGL3 протеині SAM орталық бөлігінде жинақталатынын көрсетті (Қосымша 11i сурет). pRGA::GFP-RGA желісін пайдалана отырып, біз сондай-ақ RGA протеинінің SAM-да жинақталатынын анықтадық, бірақ оның көптігі P4-тен бастап шекарада азаяды (қосымша сурет 11j). Атап айтқанда, RGL3 және RGA өрнек үлгілері qmRGA анықтағандай, IPR-да жоғары GA сигналдық белсенділігіне сәйкес келеді (4-сурет). Сонымен қатар, бұл деректер барлық DELLA-лардың SAM-де көрсетілгенін және олардың өрнектері тұтас SAM-ды қамтитынын көрсетеді.
Келесі кезекте біз жабайы типті SAM (Ler, бақылау) және gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 делла бестік (жаһандық) мутанттардағы жасушалардың бөліну параметрлерін талдадық (6а, б-сурет). Бір қызығы, біз жабайы түрмен салыстырғанда della жаһандық мутантты SAM-да жасушаның бөліну бұрышының жиіліктерінің таралуының статистикалық маңызды ауысуын байқадық (Cурет 6c). Делла жаһандық мутантының бұл өзгерісі 80–90° бұрыштар жиілігінің (34,71%-ға қарсы 24,55%) және аз дәрежеде 70-80° бұрыштардың (23,78%-ға қарсы 20,18%), яғни көлденең жасушалардың бөлінулеріне сәйкес келуімен байланысты (6c-сурет). Көлденең емес бөлінулердің жиілігі (0-60 °) делла жаһандық мутантында да төмен болды (6c-сурет). Көлденең жасушалардың бөліну жиілігі della жаһандық мутантының SAM-да айтарлықтай артты (6б-сурет). IPR-дағы көлденең жасушалардың бөліну жиілігі жабайы типпен салыстырғанда делла жаһандық мутантында да жоғары болды (6д-сурет). IPR аймағынан тыс жабайы түр жасушалардың бөліну бұрыштарының біркелкі таралуына ие болды, ал della жаһандық мутант IPR сияқты тангенциалды бөлінулерді таңдады (6e-сурет). Біз сондай-ақ GA жинақталатын GA-белсенді емес мутант фоны ga2 оксидазасының (ga2ox) бестік мутанттарының (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 және ga2ox6-2) SAM-дағы жасуша бөлімшелерінің бағдарын сандық түрде анықтадық. GA деңгейлерінің жоғарылауына сәйкес, бестік ga2ox мутантты гүлшоғырының SAM Col-0-ге қарағанда үлкен болды (Қосымша 12a, b) және Col-0-мен салыстырғанда, бестік ga2ox SAM жасушалардың бөліну бұрыштарының анық басқаша таралуын көрсетті, жиілігі 5 ° 0-дан 0-ға дейін артады. бөлімдер (Қосымша 12a–c сурет). Осылайша, біз GA сигнализациясының конститутивті активтенуі және ГА жинақталуы IPR-да және SAM-ның қалған бөлігінде жасушаның бүйірлік бөлінуін индукциялайтынын көрсетеміз.
a, b Конфокальды микроскопия арқылы PI-боялған Ler (a) және ғаламдық делла мутант (b) SAM L1 қабатының 3D визуализациясы. 10 сағаттық кезеңде SAM-да (бірақ примордиумда емес) түзілген жаңа жасуша қабырғалары бұрыш мәндеріне сәйкес көрсетіледі және боялады. Кірістірілген SAM 0 сағ. Түс жолағы төменгі оң жақ бұрышта көрсетіледі. (b) ішіндегі көрсеткі жаһандық делла мутантындағы тураланған ұяшық файлдарының мысалын көрсетеді. Ұқсас нәтижелермен эксперимент екі рет қайталанды. ce Ler және ғаламдық делла арасындағы бүкіл SAM (d), IPR (e) және IPR емес (f) бойынша жасушаның бөліну жазықтығы бағдарларының жиілік таралуын салыстыру. P мәндері екі жақты Колмогоров-Смирнов сынағы арқылы алынды. f, g Col-0 (i) және pCUC2::gai-1-VENUS (j) трансгенді өсімдіктердің PI-боялған SAM конфокальды кескіндерінің 3D визуализациясы. Панельдер (a, b) 10 сағат ішінде SAM-да пайда болған жаңа жасуша қабырғаларын (бірақ примордияны емес) көрсетеді. Ұқсас нәтижелермен эксперимент екі рет қайталанды. h–j Col-0 және pCUC2::gai-1-VENUS өсімдіктері арасындағы бүкіл SAM (h), IPR (i) және IPR емес (j) орналасқан жасушаның бөліну жазықтығы бағдарларының жиілік таралуын салыстыру. P мәндері екі жақты Колмогоров-Смирнов сынағы арқылы алынды.
Келесі кезекте біз IPR-да GA сигналын тежеу әсерін тексердік. Осы мақсатта біз VENUS (pCUC2::gai-1-VENUS сызығында) біріктірілген басым теріс gai-1 протеинінің экспрессиясын жүргізу үшін котиледон шыныаяқ 2 (CUC2) промоторын қолдандық. Жабайы типтегі SAM-де CUC2 промоторы P4-тен бастап шекаралық жасушаларды қоса, SAM-дағы көптеген IPR экспрессиясын басқарады және ұқсас ерекше өрнек pCUC2::gai-1-VENUS өсімдіктерінде байқалды (төменде қараңыз). pCUC2::gai-1-VENUS өсімдіктерінің SAM немесе IPR бойынша жасушаның бөліну бұрыштарының таралуы жабайы түрдегіден айтарлықтай ерекшеленбеді, дегенмен күтпеген жерден біз бұл өсімдіктерде IPR жоқ жасушалардың 80-90° жоғары жиілікте бөлінгенін анықтадық (6f–j сурет).
Жасушаның бөліну бағыты SAM геометриясына, атап айтқанда тіндердің қисаюынан туындайтын созылу кернеуіне байланысты деген болжам бар46. Сондықтан біз SAM пішінінің della жаһандық мутантында және pCUC2::gai-1-VENUS өсімдіктерінде өзгергенін сұрадық. Бұрын хабарланғандай12, della жаһандық мутант SAM өлшемі жабайы түрге қарағанда үлкенірек болды (Қосымша 13a, b, d-сурет). CLV3 және STM РНҚ-ның in situ гибридизациясы делла мутанттарындағы меристеманың кеңеюін растады және одан әрі дің жасушаларының ұясының бүйірлік кеңеюін көрсетті (қосымша 13e, f, h, i сурет). Дегенмен, SAM қисаюы екі генотипте де ұқсас болды (Қосымша сурет 13k, m, n, p). Біз gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della төрттік мутантында жабайы түрмен салыстырғанда қисықтық өзгеріссіз өлшемнің ұқсас өсуін байқадық (Қосымша сурет 13c, d, g, j, l, o, p). Жасушаның бөліну бағытының жиілігі делла төрттік мутантында да әсер етті, бірақ делла монолитті мутантқа қарағанда аз дәрежеде (қосымша 12d-f сурет). Бұл мөлшерлеу әсері қисықтыққа әсер етпеуімен қатар, Della төрттік мутантындағы қалдық RGL3 белсенділігі DELLA белсенділігінің жоғалуынан туындаған жасушаның бөліну бағдарындағы өзгерістерді шектейтінін және жасушаның бүйірлік бөлінулеріндегі өзгерістер SAM геометриясындағы өзгерістерге емес, GA сигналдық белсенділігінің өзгеруіне жауап ретінде болатынын болжайды. Жоғарыда сипатталғандай, CUC2 промоторы P4-тен басталатын SAM-де IPR өрнегін басқарады (қосымша 14a, b) және керісінше, pCUC2::gai-1-VENUS SAM өлшемі кішірейген, бірақ қисықтығы жоғары болды (Қосымша 14c-h сурет). pCUC2::gai-1-VENUS SAM морфологиясының бұл өзгерісі жабайы түрімен салыстырғанда механикалық кернеулердің басқаша таралуына әкелуі мүмкін, онда жоғары айналмалы кернеулер SAM орталығынан қысқарақ қашықтықта басталады47. Балама ретінде, pCUC2::gai-1-VENUS SAM морфологиясындағы өзгерістер трансген экспрессиясы арқылы индукцияланған аймақтық механикалық қасиеттердің өзгеруінен туындауы мүмкін48. Екі жағдайда да, бұл біздің бақылауларымызды түсіндіре отырып, жасушалардың айналмалы/көлденең бағытта бөліну ықтималдығын арттыру арқылы GA сигналындағы өзгерістердің әсерін ішінара өтеуі мүмкін.
Бірге алғанда, біздің деректеріміз жоғары GA сигнализациясының IPR-да жасушаның бөліну жазықтығының бүйірлік бағдарлануында белсенді рөл атқаратынын растайды. Сондай-ақ олар меристеманың қисаюы ИПР-да жасушаның бөліну жазықтығының бағытына да әсер ететінін көрсетеді.
IPR-да бөліну жазықтығының көлденең бағыты, жоғары GA сигналдық белсенділігіне байланысты, GA кейінірек эпидермисаралық түйінде табылатын жасушалық ұйымды анықтау үшін SAM ішіндегі эпидермистегі радиалды жасуша файлын алдын ала ұйымдастырады деп болжайды. Шынында да, мұндай ұяшық файлдары della жаһандық мутанттарының SAM кескіндерінде жиі көрінетін (6б-сурет). Осылайша, SAM-да GA сигнализациясының кеңістіктік үлгісінің даму функциясын одан әрі зерттеу үшін біз жабайы типтегі (Ler және Col-0), делла жаһандық мутанттарында және pCUC2 :: gai-1-VENUS трансгендік өсімдіктерінде IPR-дағы жасушалардың кеңістіктік ұйымын талдау үшін уақыт аралығымен бейнелеуді қолдандық.
Біз qmRGA IPR-дағы GA сигналдық белсенділігінің P1/P2-ден артып, P4-те шыңына жеткенін және бұл үлгі уақыт өте келе тұрақты болып қалатынын көрсетті (4a-f суреті және қосымша 8c-f, k суреті). GA сигналының жоғарылауымен IPR жасушаларының кеңістіктік ұйымын талдау үшін біз Ler IPR жасушаларын P4 жоғары және жақтарына бірінші бақылаудан кейін 34 сағаттан кейін талданған даму тағдырына сәйкес белгіледік, яғни екі пластидтік уақыттан астам, бұл P1/P2-ден P4-ке дейінгі примордиумның дамуы кезінде IPR жасушаларын қадағалауға мүмкіндік береді. Біз үш түрлі түсті қолдандық: P4 жанындағы примордиумға біріктірілген ұяшықтар үшін сары, IPR-да болғандар үшін жасыл және екі процеске қатысқандар үшін күлгін (сурет 7a–c). t0 (0 сағ) кезінде P4 алдында IPR жасушаларының 1-2 қабаты көрінді (7а-сурет). Күтілгендей, бұл жасушалар бөлінгенде, олар мұны негізінен көлденең бөліну жазықтығы арқылы жасады (7a–c-суреттер). Ұқсас нәтижелер Col-0 SAM көмегімен алынды (шекарасы Лердегі P4 қатпарларына ұқсас P3-ке назар аударылады), дегенмен бұл генотипте флоралық шекарада пайда болған қатпар IPR жасушаларын тезірек жасырады (7g–i-сурет). Осылайша, IPR жасушаларының бөліну үлгісі жасушаларды түйінаралықтардағы сияқты радиалды жолдарға алдын ала ұйымдастырады. Радиалды қатарлардың ұйымдастырылуы және бірізді мүшелер арасындағы IPR жасушаларының локализациясы бұл жасушалардың түйінаралық прогениторлар екендігін көрсетеді.
Мұнда біз GA және GA рецепторларының біріктірілген концентрацияларынан туындайтын GA сигнал беру белсенділігін сандық картаға түсіруге мүмкіндік беретін, эндогендік сигналдық жолдармен кедергілерді азайта отырып, осылайша ұялы деңгейде GA функциясы туралы ақпаратты қамтамасыз ететін рационметриялық GA сигналдық биосенсорын, qmRGA әзірледік. Осы мақсатта біз DELLA өзара әрекеттесу серіктестерін байланыстыру қабілетін жоғалтқан, бірақ GA-индукцияланған протеолизге сезімтал болып қалатын модификацияланған DELLA протеинін, mRGA құрастырдық. qmRGA GA деңгейлеріндегі экзогендік және эндогендік өзгерістерге жауап береді және оның динамикалық сезіну қасиеттері даму кезінде GA сигнал беру белсенділігіндегі кеңістік-уақыттық өзгерістерді бағалауға мүмкіндік береді. qmRGA сонымен қатар өте икемді құрал болып табылады, өйткені оны экспрессиялау үшін пайдаланылатын промоторды өзгерту арқылы (қажет болса) әртүрлі тіндерге бейімделуге болады және GA сигнал беру жолының сақталған сипатын және ангиоспермдерге PFYRE мотивін ескере отырып, ол басқа түрлерге ауысуы мүмкін22. Осыған сәйкес, күріш SLR1 DELLA протеиніндегі (HYY497AAA) баламалы мутация да SLR1 өсу репрессорлық белсенділігін басатыны және оның mRGA23-ке ұқсас GA-делдалдық деградациясын сәл ғана төмендеткені көрсетілген. Арабидопсистегі соңғы зерттеулер PFYRE доменіндегі (S474L) бір аминқышқылдық мутация RGA транскрипциялық белсенділігін оның транскрипция факторы серіктестерімен әрекеттесу қабілетіне әсер етпестен өзгерткенін көрсетті50. Бұл мутация mRGA-да бар 3 амин қышқылы алмастыруларына өте жақын болғанымен, біздің зерттеулеріміз бұл екі мутация DELLA-ның ерекше сипаттамаларын өзгертетінін көрсетеді. Транскрипция факторының серіктестерінің көпшілігі DELLA26,51 LHR1 және SAW домендерімен байланысқанымен, PFYRE доменіндегі кейбір сақталған аминқышқылдары осы өзара әрекеттесуді тұрақтандыруға көмектесуі мүмкін.
Түйінаралық даму - өсімдік сәулетіндегі және өнімділікті арттырудағы негізгі қасиет. qmRGA IPR түйінаралық прогениторлық жасушаларда жоғары GA сигналдық белсенділігін анықтады. Сандық бейнелеу мен генетиканы біріктіре отырып, біз GA сигналдық үлгілері SAM эпидермисіндегі дөңгелек/көлденең жасушалық бөліну жазықтықтарын қосатынын көрсеттік, бұл түйінаралық даму үшін қажетті жасушаның бөліну ұйымын қалыптастырады. Жасушаның бөліну жазықтығы бағдарының бірнеше реттегіштері даму барысында анықталған52,53. Біздің жұмысымыз GA сигнал беру белсенділігі осы ұялы параметрді қалай реттейтінінің айқын мысалын береді. DELLA алдын ала қатпарланатын ақуыз кешендерімен әрекеттесе алады41, сондықтан GA сигнализациясы кортикальды микротүтікшелердің бағдарына тікелей әсер ету арқылы жасушаның бөліну жазықтығының бағдарын реттей алады40,41,54,55. Біз күтпеген жерден SAM-де жоғары GA сигналдық белсенділігінің корреляциясы жасуша ұзаруы немесе бөлінуі емес, тек өсу анизотропиясы болды, бұл ГА-ның IPR-да жасушаның бөліну бағытына тікелей әсеріне сәйкес келеді. Дегенмен, біз бұл әсердің жанама болуы мүмкін екенін жоққа шығара алмаймыз, мысалы, GA-индукцияланған жасуша қабырғасының жұмсаруы56 арқылы. Жасуша қабырғасының қасиеттерінің өзгеруі механикалық кернеуді тудырады57,58, ол сондай-ақ кортикальды микротүтіктердің бағытына әсер ету арқылы жасушаның бөліну жазықтығының бағдарына әсер етуі мүмкін39,46,59. GA-индукцияланған механикалық кернеудің және микротүтіктердің бағдарлануын ГА арқылы тікелей реттеудің біріктірілген әсерлері түйін аралықтарды анықтау үшін IPR-да жасуша бөліну бағдарының нақты үлгісін жасауға қатысуы мүмкін және бұл идеяны тексеру үшін қосымша зерттеулер қажет. Сол сияқты, алдыңғы зерттеулер DELLA өзара әрекеттесетін TCP14 және 15 белоктарының түйін аралық түзілуін бақылаудағы маңыздылығын атап көрсетті60,61 және бұл факторлар түйін аралық дамуын реттейтін BREVIPEDICELLUS (BP) және PENNYWISE (PNY) бірге GA әрекетіне делдалдық етуі мүмкін және GA2 сигналына әсер ететіні көрсетілген. DELLA брассиностероид, этилен, жасмон қышқылы және абсцизин қышқылы (ABA) сигнал беру жолдарымен әрекеттесетінін ескере отырып63,64 және бұл гормондар микротүтікшелердің бағдарлануына65 әсер етуі мүмкін екенін ескере отырып, GA-ның жасушаның бөліну бағдарына әсері басқа гормондар арқылы да болуы мүмкін.
Ерте цитологиялық зерттеулер Арабидопсис SAM ішкі және сыртқы аймақтарының түйінаралық дамуы үшін қажет екенін көрсетті2,42. GA ішкі тіндердегі жасушалардың бөлінуін белсенді түрде реттейтіні12 ГА-ның САМ-дағы меристема мен түйінаралық өлшемді реттеудегі қосарлы функциясын қолдайды. Бағытталған жасушалардың бөліну үлгісі ішкі SAM тінінде де қатаң реттеледі және бұл реттеу сабақтың өсуі үшін маңызды52. GA сонымен қатар ішкі SAM ұйымындағы жасушалардың бөліну жазықтығын бағдарлауда рөл атқаратынын, осылайша SAM ішіндегі түйінаралықтардың спецификациясы мен дамуын синхрондайтынын зерттеу қызықты болады.
Өсімдіктер in vitro топырақта немесе 1% сахароза және 1% агар (Сигма) қосылған 1x Murashige-Skoog (MS) қоректік ортасында (Duchefa) стандартты жағдайларда (16 сағат жарық, 22 °C) өсірілді, гипокотил мен тамырдың өсу тәжірибесін қоспағанда, көшеттер тұрақты жарықта және 2 °C тік тақталарда өсірілді. Нитрат тәжірибелері үшін өсімдіктер ұзақ күн жағдайында жеткілікті нитратпен (0 немесе 10 мМ KNO3), 0,5 мМ NH4-сукцинатпен, 1% сахарозамен және 1% А-агармен (Сигма) толықтырылған модификацияланған MS ортасында (bioWORLD өсімдік ортасы) өсірілді.
pDONR221 ішіне енгізілген GID1a cDNA pUBQ10::GID1a-mCherry генерациялау үшін pDONR P4-P1R-pUBQ10 және pDONR P2R-P3-mCherry pB7m34GW ішіне қайта біріктірілді. pDONR221 ішіне енгізілген IDD2 ДНҚ p35S:IDD2-RFP жасау үшін pB7RWG266 ішіне қайта біріктірілді. pGID1b::2xmTQ2-GID1b генерациялау үшін GID1b кодтау аймағының жоғары жағындағы 3,9 кб фрагменті және GID1b cDNA (1,3 кб) мен терминаторы (3,4 кб) бар 4,7 кб фрагмент алдымен P3-R4 қосымшасындағы праймерлерді пайдаланып күшейтілді, содан кейін P14-ге қосылады. (Thermo Fisher Scientific) және pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), сәйкесінше, және ақырында, Gateway клондау арқылы pGreen 012567 мақсатты векторына pDONR221 2xmTQ268 қайта біріктірілді. pCUC2::LSSmOrange генерациялау үшін CUC2 промотор тізбегі (ATG ағынынан жоғары 3229 бит), одан кейін N7 ядролық локализация сигналы бар үлкен Стокспен ығысқан mOrange (LSSmOrange)69 кодтау тізбегі және NOS транскрипциялық терминаторы pGreate kancinamy kancinamy векторын пайдаланып pGreenfrag3-векторының көмегімен жиналды. рекомбинация жүйесі (Инвитроген). Өсімдіктің екілік векторы Agrobacterium tumefaciens GV3101 штаммына енгізілді және сәйкесінше Agrobacterium инфильтрация әдісімен Nicotiana benthamiana жапырақтарына және гүлді батыру әдісімен Arabidopsis thaliana Col-0 енгізілді. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry және pCLV3::mCherry-NLS qmRGA сәйкес кресттердің F3 және F1 ұрпақтарынан оқшауланды.
РНҚ in situ гибридизациясы шамамен 1 см ұзындықтағы қашу ұштарында орындалды72, олар жиналып, 4 °C дейін алдын ала салқындатылған FAA ерітіндісінде (3,7% формальдегид, 5% сірке қышқылы, 50% этанол) дереу бекітілді. 2 × 15 мин вакуумдық өңдеуден кейін фиксатор ауыстырылды және үлгілер түнде инкубацияланды. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 және RGL3 cDNA және олардың 3′-UTR-ге антисенс зондтары Rosier және т.б.73 сипаттаған 3-кестеде көрсетілген праймерлердің көмегімен синтезделді. Дигоксигенинмен таңбаланған зондтар дигоксигенин антиденелерін (3000 есе сұйылту; Роше, каталог нөмірі: 11 093 274 910) пайдаланып иммунды анықтады және кесінділер 5-бром-4-хлоро-3-индолилфосфатпен (BCIP-те 250 разбавления) боялды. (НБТ, 200 есе сұйылту) ерітіндісі.
Жіберу уақыты: 10 ақпан 2025 ж