Өскіннің апикальды меристемасының (ӨАМ) өсуі сабақ құрылымы үшін өте маңызды. Өсімдік гормондарыгиббереллиндер(GA) өсімдіктердің өсуін үйлестіруде маңызды рөл атқарады, бірақ олардың SAM-дағы рөлі әлі күнге дейін толық түсінілмеген. Мұнда біз DELLA ақуызын GA транскрипциялық реакциясындағы маңызды реттеуші функциясын басу үшін инженериялау арқылы GA сигнал берудің коэффициенттік биосенсорын жасадық, сонымен қатар GA тану кезінде оның ыдырауын сақтап қалдық. Біз бұл ыдырауға негізделген биосенсордың GA деңгейлеріндегі және даму кезіндегі жасушалық сезімталдықтағы өзгерістерді дәл тіркейтінін көрсетеміз. Біз бұл биосенсорды SAM-дағы GA сигнал беру белсенділігін картаға түсіру үшін пайдаландық. Біз жоғары GA сигналдарының негізінен түйіндер аралық жасушалардың прекурсорлары болып табылатын органның алғашқы жасушалары арасында орналасқан жасушаларда болатынын көрсетеміз. Функцияның пайда болуы мен жоғалуы тәсілдерін қолдана отырып, біз GA жасуша бөліну жазықтығының бағытын реттейтінін, түйіндер аралықтарының канондық жасушалық ұйымын орнататынын, осылайша SAM-да түйіндер аралық спецификацияны ілгерілететінін көрсетеміз.
Өркеннің ұшында орналасқан өркеннің апикальды меристемасы (ӨАМ) өсімдіктің өмір бойы модульдік және итеративті түрде бүйірлік мүшелер мен сабақ түйіндерін тудыратын бағаналы жасушалардың орнын қамтиды. Бұл қайталанатын бірліктердің немесе өсімдік түйіндерінің әрқайсысына түйіндердегі түйіндер аралықтары мен бүйірлік мүшелер, сондай-ақ жапырақ қолтықтарындағы қолтық асты меристемалары кіреді1. Өсімдік түйіндерінің өсуі мен ұйымдастырылуы даму кезінде өзгереді. Арабидопсисте вегетативті кезеңде түйіндер аралық өсуі басылады, ал қолтық асты меристемалары розетка жапырақтарының қолтықтарында ұйықтап қалады. Гүлді фазаға өту кезінде ӨАМ гүл шоғырының меристемасына айналады, созылған түйіндер мен қолтық асты бүршіктерін, гүлді жапырақтардың қолтықтарындағы бұтақшаларды және кейінірек жапырақсыз гүлдерді түзеді2. Жапырақтардың, гүлдердің және бұтақтардың пайда болуын басқаратын механизмдерді түсінуде айтарлықтай ілгерілеушілікке қол жеткізгенімізбен, түйіндер аралықтарының қалай пайда болатыны туралы салыстырмалы түрде аз мәлімет бар.
GA-лардың кеңістіктік-уақыттық таралуын түсіну бұл гормондардың әртүрлі тіндердегі және әртүрлі даму кезеңдеріндегі функцияларын жақсырақ түсінуге көмектеседі. Өз промоторының әсерінен көрінетін RGA-GFP бірігуінің ыдырауын визуализациялау тамырлардағы жалпы GA деңгейлерінің реттелуі туралы маңызды ақпарат береді15,16. Дегенмен, RGA экспрессиясы тіндерде өзгереді17 және GA18 арқылы реттеледі. Осылайша, RGA промоторының дифференциалды экспрессиясы RGA-GFP арқылы байқалатын флуоресценция үлгісіне әкелуі мүмкін, сондықтан бұл әдіс сандық емес. Жақында биоактивті флуоресцеин (Fl)-белгіленген GA19,20 түбір эндокортексінде GA жиналуын және оның жасушалық деңгейлерінің GA тасымалымен реттелуін анықтады. Жақында GA FRET сенсоры nlsGPS1 GA деңгейлерінің тамырлардағы, жіпшелердегі және қараңғы өскен гипокотилдердегі21 жасуша созылуымен корреляцияланатынын көрсетті. Дегенмен, көріп отырғанымыздай, GA концентрациясы GA сигнал беру белсенділігін басқаратын жалғыз параметр емес, себебі ол күрделі сенсорлық процестерге байланысты. Мұнда, DELLA және GA сигнал беру жолдарын түсінуімізге сүйене отырып, біз GA сигнал беру үшін деградацияға негізделген коэффициенттік биосенсордың әзірленуі мен сипаттамасын ұсынамыз. Бұл сандық биосенсорды әзірлеу үшін біз флуоресцентті ақуызға біріктірілген және тіндерде барлық жерде экспрессияланған мутант GA-сезімтал RGA, сондай-ақ GA-сезімсіз флуоресцентті ақуызды қолдандық. Біз мутантты RGA ақуыздарының бірігуі барлық жерде экспрессияланған кезде эндогенді GA сигнал беруіне кедергі келтірмейтінін және бұл биосенсор сенсорлық аппараттың GA кірісі мен GA сигналын өңдеу нәтижесінде пайда болатын сигнал беру белсенділігін жоғары кеңістіктік-уақыттық ажыратымдылықпен сандық түрде анықтай алатынын көрсетеміз. Біз бұл биосенсорды GA сигнал беру белсенділігінің кеңістіктік-уақыттық таралуын картаға түсіру және GA-ның SAM эпидермисінде жасушалық мінез-құлықты қалай реттейтінін сандық түрде анықтау үшін қолдандық. Біз GA-ның бастапқы мүшелер арасында орналасқан SAM жасушаларының бөліну жазықтығының бағытын реттейтінін, осылайша түйіндер аралықтың канондық жасушалық ұйымын анықтайтынын көрсетеміз.
Соңында, біз өсіп келе жатқан гипокотилдерді қолдана отырып, qmRGA эндогендік GA деңгейлерінің өзгерістерін хабарлай ала ма деп сұрадық. Біз бұрын нитраттың GA синтезін және өз кезегінде DELLA34 ыдырауын арттыру арқылы өсуді ынталандыратынын көрсеттік. Тиісінше, біз мол нитратпен (10 мМ NO3−) өсірілген pUBQ10::qmRGA көшеттерінің гипокотил ұзындығы нитрат жетіспейтін жағдайларда өсірілген көшеттерге қарағанда айтарлықтай ұзын екенін байқадық (Қосымша 6a сурет). Өсу реакциясына сәйкес, GA сигналдары 10 мМ NO3− жағдайларда өсірілген көшеттердің гипокотилдерінде нитрат болмаған жағдайда өсірілген көшеттерге қарағанда жоғары болды (Қосымша 6b, c сурет). Осылайша, qmRGA сонымен қатар GA концентрациясының эндогендік өзгерістерінен туындаған GA сигналдарының өзгерістерін бақылауға мүмкіндік береді.
qmRGA арқылы анықталған GA сигнал беру белсенділігінің GA концентрациясына және GA қабылдауына тәуелді екенін түсіну үшін, сенсор дизайнына сүйене отырып, күтілгендей, біз вегетативті және репродуктивті тіндердегі үш GID1 рецепторының экспрессиясын талдадық. Көшеттерде GID1-GUS репортерлік желісі GID1a және c жапырақшаларда жоғары экспрессияланғанын көрсетті (3a–c сурет). Сонымен қатар, үш рецептордың барлығы жапырақтарда, бүйірлік тамыр примордияларында, тамыр ұштарында (GID1b тамыр қақпағынан басқа) және тамыр жүйесінде экспрессияланды (3a–c сурет). Гүлшоғыр SAM-да біз тек GID1b және 1c үшін GUS сигналдарын анықтадық (қосымша 7a–c сурет). In situ будандастыру бұл экспрессия үлгілерін растады және GID1c SAM-да төмен деңгейде біркелкі экспрессияланғанын, ал GID1b SAM шеткері аймағында жоғары экспрессияны көрсеткенін көрсетті (қосымша 7d–l сурет). pGID1b::2xmTQ2-GID1b трансляциялық бірігуі сонымен қатар SAM орталығындағы төмен немесе экспрессияның болмауынан бастап, мүше шекараларындағы жоғары экспрессияға дейін GID1b экспрессиясының сатылы диапазонын анықтады (7m қосымша сурет). Осылайша, GID1 рецепторлары тіндер арасында және ішінде біркелкі таралмаған. Кейінгі тәжірибелерде біз GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) шамадан тыс экспрессиясы гипокотилдердегі qmRGA сезімталдығын сыртқы GA қолдануына арттыратынын байқадық (3d, e сурет). Керісінше, гипокотилде qd17mRGA арқылы өлшенген флуоресценция GA3 еміне сезімтал болмады (3f, g сурет). Екі талдау үшін де сенсордың жылдам әрекетін бағалау үшін көшеттер GA жоғары концентрациясымен (100 мкМ GA3) өңделді, мұнда GID1 рецепторымен байланысу қабілеті артты немесе жоғалды. Бұл нәтижелер бірге qmRGA биосенсорының GA және GA сенсоры ретінде біріккен функцияны атқаратынын растайды және GID1 рецепторының дифференциалды экспрессиясы сенсордың сәулеленуін айтарлықтай модуляциялай алатынын көрсетеді.
Бүгінгі күнге дейін SAM-дағы GA сигналдарының таралуы белгісіз болып қала береді. Сондықтан біз qmRGA экспрессиялайтын өсімдіктерді және pCLV3::mCherry-NLS бағаналы жасуша репортерін35 пайдаланып, GA сигнал беру белсенділігінің жоғары ажыратымдылықтағы сандық карталарын есептедік, L1 қабатына (эпидермис; 4a, b сурет, Әдістер мен қосымша әдістерді қараңыз) назар аудардық, себебі L1 SAM өсуін басқаруда маңызды рөл атқарады36. Мұнда pCLV3::mCherry-NLS экспрессиясы GA сигнал беру белсенділігінің кеңістіктік-уақыттық таралуын талдау үшін бекітілген геометриялық анықтамалық нүктені қамтамасыз етті37. GA бүйірлік мүшелердің дамуы үшін маңызды деп саналғанымен4, біз P3 сатысынан бастап гүлді примордиумда (P) GA сигналдарының төмен екенін байқадық (4a, b сурет), ал жас P1 және P2 примордиумдарында орталық аймақтағыға ұқсас орташа белсенділік болды (4a, b сурет). Жоғары GA сигнал беру белсенділігі P1/P2-ден (шекараның бүйірлерінен) басталып, P4-ке дейін жететін органның алғашқы шекараларында, сондай-ақ алғашқы шекаралар арасында орналасқан шеткергі аймақтың барлық жасушаларында анықталды (4a, b сурет және қосымша 8a, b сурет). Бұл жоғары GA сигнал беру белсенділігі тек эпидермисте ғана емес, сонымен қатар L2 және жоғарғы L3 қабаттарында да байқалды (қосымша 8b сурет). qmRGA көмегімен SAM-да анықталған GA сигналдарының үлгісі уақыт өте келе өзгеріссіз қалды (қосымша 8c–f, k сурет). qd17mRGA құрылымы біз егжей-тегжейлі сипаттаған бес тәуелсіз сызықтан алынған T3 өсімдіктерінің SAM-ында жүйелі түрде төмендетілгенімен, біз pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP құрылымымен алынған флуоресценция үлгілерін талдай алдық (қосымша 8g–j сурет, l). Бұл бақылау сызығында SAM-да флуоресценция коэффициентінің тек шамалы өзгерістері анықталды, бірақ SAM орталығында біз TagBFP-мен байланысты VENUS-тің айқын және күтпеген төмендеуін байқадық. Бұл qmRGA байқаған сигнал беру үлгісі mRGA-VENUS-тің GA-тәуелді деградациясын көрсететінін растайды, сонымен қатар qmRGA меристема орталығындағы GA сигнал беру белсенділігін асыра бағалауы мүмкін екенін көрсетеді. Қорытындылай келе, біздің нәтижелеріміз негізінен примордиялардың таралуын көрсететін GA сигнал беру үлгісін көрсетеді. Алғашқыаралық аймақтың (IPR) бұл таралуы дамып келе жатқан примордия мен орталық аймақ арасында жоғары GA сигнал беру белсенділігінің біртіндеп орнауына байланысты, сонымен бірге примордиядағы GA сигнал беру белсенділігі төмендейді (4c, d сурет).
GID1b және GID1c рецепторларының таралуы (жоғарыдан қараңыз) GA рецепторларының дифференциалды экспрессиясы SAM-дағы GA сигнал беру белсенділігінің үлгісін қалыптастыруға көмектесетінін көрсетеді. Біз GA-ның дифференциалды жинақталуы мүмкін бе деп ойладық. Бұл мүмкіндікті зерттеу үшін біз nlsGPS1 GA FRET сенсорын21 қолдандық. 100 минут бойы 10 мкМ GA4+7-мен өңделген nlsGPS1 SAM-да активация жиілігінің жоғарылауы анықталды (9a–e қосымша сурет), бұл nlsGPS1-дің SAM-дағы GA концентрациясының өзгеруіне, түбірлерде21 сияқты жауап беретінін көрсетеді. nlsGPS1 активация жиілігінің кеңістіктік таралуы SAM-ның сыртқы қабаттарында GA деңгейлерінің салыстырмалы түрде төмен екенін көрсетті, бірақ олардың SAM-ның ортасында және шекараларында жоғарылағанын көрсетті (4e сурет және 9a,c қосымша сурет). Бұл GA-ның SAM-да qmRGA арқылы анықталғанға ұқсас кеңістіктік үлгімен таралғанын көрсетеді. Қосымша тәсіл ретінде біз SAM-ды флуоресцентті GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) немесе теріс бақылау ретінде тек Fl-мен өңдедік. Fl сигналы орталық аймақ пен примордийді қоса алғанда, SAM бойынша таралды, бірақ төмен қарқындылықта болды (4j-сурет және қосымша 10d-сурет). Керісінше, үш GA-Fl да бастапқы шекараларда және IPR-дің қалған бөлігінде әртүрлі дәрежеде жинақталды, ал GA7-Fl IPR-дегі ең үлкен доменде жиналды (4k-сурет және қосымша 10a,b-сурет). Флуоресценция қарқындылығын сандық бағалау GA-Fl-мен өңделген SAM-да IPR-дің IPR емес қарқындылығына қатынасы Fl-мен өңделген SAM-мен салыстырғанда жоғары екенін көрсетті (4l-сурет және қосымша 10c-сурет). Жалпы алғанда, бұл нәтижелер GA орган шекарасына ең жақын орналасқан IPR жасушаларында жоғары концентрацияда болатынын көрсетеді. Бұл SAM GA сигнал беру белсенділігінің үлгісі GA рецепторларының дифференциалды экспрессиясынан және мүше шекараларына жақын IPR жасушаларында GA дифференциалды жинақталуынан туындайтынын көрсетеді. Осылайша, біздің талдауымыз GA сигнал берудің күтпеген кеңістіктік-уақыттық үлгісін анықтады, SAM орталығы мен примордиумында белсенділік төмен, ал шеткергі аймақта IPR белсенділігі жоғарырақ.
SAM-дағы дифференциалды GA сигнал беру белсенділігінің рөлін түсіну үшін біз SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS нақты уақыт режиміндегі бейнелеуді қолдана отырып, GA сигнал беру белсенділігі, жасуша кеңеюі және жасуша бөлінуі арасындағы корреляцияны талдадық. Өсуді реттеудегі GA рөлін ескере отырып, жасуша кеңею параметрлерімен оң корреляция күтілді. Сондықтан, біз алдымен GA сигнал беру белсенділігі карталарын жасуша бетінің өсу жылдамдығының карталарымен (берілген жасуша үшін және бөліну кезіндегі аналық жасушалар үшін жасуша кеңеюінің күшіне прокси ретінде) және жасуша кеңеюінің бағытын өлшейтін өсу анизотропиясының карталарымен салыстырдық (мұнда берілген жасуша үшін және бөліну кезіндегі аналық жасушалар үшін де қолданылады; 5a,b сурет, Әдістер мен қосымша әдістерді қараңыз). SAM жасуша бетінің өсу жылдамдығының карталары бұрынғы бақылаулармен38,39 сәйкес келеді, шекарада минималды өсу қарқыны және дамып келе жатқан гүлдердің максималды өсу қарқыны бар (5a сурет). Негізгі компонентті талдау (PCA) GA сигнал беру белсенділігі жасуша бетінің өсу қарқындылығымен теріс корреляцияланғанын көрсетті (5c сурет). Біз сондай-ақ GA сигнал беру кірісі мен өсу қарқындылығын қоса алғанда, вариацияның негізгі осьтерінің жоғары CLV3 экспрессиясымен анықталған бағытқа ортогональды екенін көрсеттік, бұл қалған талдауларда SAM орталығынан жасушалардың алынып тасталғанын растайды. Спирмен корреляциялық талдауы PCA нәтижелерін растады (5d-сурет), бұл IPR-дегі жоғары GA сигналдары жасушаның жоғары кеңеюіне әкелмегенін көрсетеді. Дегенмен, корреляциялық талдау GA сигнал беру белсенділігі мен өсу анизотропиясы арасындағы шамалы оң корреляцияны анықтады (5c, d-сурет), бұл IPR-дегі жоғары GA сигнал беру жасушаның өсу бағытына және, мүмкін, жасушаның бөліну жазықтығының орналасуына әсер ететінін көрсетеді.
a, b SAM-дағы орташа беттік өсудің (a) және өсу анизотропиясының (b) жылу карталары жеті тәуелсіз өсімдік бойынша орташаланды (жасуша кеңеюінің күші мен бағытының проксилері ретінде пайдаланылды). c PCA талдауы келесі айнымалыларды қамтыды: GA сигналы, беттік өсу қарқындылығы, беттік өсу анизотропиясы және CLV3 экспрессиясы. PCA компоненті 1 негізінен беттік өсу қарқындылығымен теріс корреляцияланған және GA сигналымен оң корреляцияланған. PCA компоненті 2 негізінен беттік өсу анизотропиясымен оң корреляцияланған және CLV3 экспрессиясымен теріс корреляцияланған. Пайыздар әр компонентпен түсіндірілген ауытқуды білдіреді. d CZ қоспағанда, тін масштабындағы GA сигналы, беттік өсу қарқындылығы және беттік өсу анизотропиясы арасындағы Спирман корреляциялық талдауы. Оң жақтағы сан - екі айнымалы арасындағы Спирман rho мәні. Жұлдызшалар корреляция/теріс корреляция өте маңызды болған жағдайларды көрсетеді. e Col-0 SAM L1 жасушаларын конфокальды микроскопия арқылы 3D визуализациялау. 10 сағаттан кейін SAM-да (бірақ примордиумда емес) пайда болған жаңа жасуша қабырғалары бұрыш мәндеріне сәйкес боялған. Түс жолағы төменгі оң жақ бұрышта көрсетілген. Кірістірілген суретте 0 сағаттан кейін сәйкес 3D кескін көрсетілген. Тәжірибе ұқсас нәтижелермен екі рет қайталанды. f Қорап графиктері IPR және IPR емес Col-0 SAM-да (n = 10 тәуелсіз өсімдік) жасушалардың бөліну жылдамдығын көрсетеді. Орталық сызық медиананы, ал қорап шекаралары 25-ші және 75-ші процентильдерді көрсетеді. Мұрттар R бағдарламалық жасақтамасымен анықталған минималды және максималды мәндерді көрсетеді. P мәндері Уэлчтің екі жақты t-тестімен алынды. g, h (g) SAM орталығынан радиалды бағытқа қатысты жаңа жасуша қабырғасының (қызыл күрең) бұрышын қалай өлшеу керектігін көрсететін схема (ақ нүктелі сызық) (тек өткір бұрыш мәндері, яғни 0–90° ескеріледі) және (h) меристема ішіндегі шеңберлік/бүйірлік және радиалды бағыттарды көрсетеді. i SAM (қою көк), IPR (орташа көк) және IPR емес (ашық көк) бойынша жасуша бөліну жазықтығының бағдарлануының жиілік гистограммалары. P мәндері екі жақты Колмогоров-Смирнов сынағы арқылы алынды. Тәжірибе ұқсас нәтижелермен екі рет қайталанды. j IPR-дің P3 (ашық жасыл), P4 (орташа жасыл) және P5 (қою жасыл) айналасындағы жасуша бөліну жазықтығының бағдарлануының жиілік гистограммалары. P мәндері екі жақты Колмогоров-Смирнов сынағы арқылы алынды. Тәжірибе ұқсас нәтижелермен екі рет қайталанды.
Сондықтан, біз талдау кезінде жаңадан пайда болған жасуша қабырғаларын анықтау арқылы GA сигнализациясы мен жасуша бөліну белсенділігі арасындағы корреляцияны зерттедік (5e-сурет). Бұл тәсіл бізге жасуша бөлінуінің жиілігі мен бағытын өлшеуге мүмкіндік берді. Таңқаларлығы, біз IPR және SAM-ның қалған бөлігіндегі (IPR емес, 5f-сурет) жасуша бөліну жиілігі ұқсас екенін анықтадық, бұл IPR және IPR емес жасушалар арасындағы GA сигнализациясындағы айырмашылықтар жасуша бөлінуіне айтарлықтай әсер етпейтінін көрсетеді. Бұл және GA сигнализациясы мен өсу анизотропиясы арасындағы оң корреляция бізді GA сигнализация белсенділігі жасуша бөліну жазықтығының бағытына әсер етуі мүмкін бе деген мәселені қарастыруға итермеледі. Біз жаңа жасуша қабырғасының бағытын меристема орталығы мен жаңа жасуша қабырғасының орталығын байланыстыратын радиалды осіне қатысты сүйір бұрыш ретінде өлшедік (5e-i сурет) және жасушалардың радиалды осіне қатысты 90°-қа жақын бұрыштарда бөлінуінің айқын үрдісін байқадық, ең жоғары жиіліктер 70–80° (23,28%) және 80–90° (22,62%) (5e,i сурет) аралығында байқалды, бұл шеңбер бойымен/көлденең бағыттағы жасуша бөлінулеріне сәйкес келеді (5h сурет). GA сигнализациясының жасуша бөлінуінің осы мінез-құлқына қосқан үлесін зерттеу үшін біз IPR және IPR емес жасуша бөліну параметрлерін бөлек талдадық (5i сурет). Біз IPR жасушаларындағы бөліну бұрышының таралуы IPR емес жасушалардағы немесе бүкіл SAM жасушаларындағыдан өзгеше екенін байқадық, IPR жасушалары бүйірлік/шеңберлік жасуша бөлінулерінің жоғары үлесін көрсетеді, яғни 70–80° және 80–90° (сәйкесінше 33,86% және 30,71%) (5i-сурет). Осылайша, біздің бақылауларымыз жоғары GA сигнализациясы мен шеңбер бағытына жақын жасуша бөліну жазықтығының бағдары арасындағы байланысты анықтады, бұл GA сигнализация белсенділігі мен өсу анизотропиясы арасындағы корреляцияға ұқсас (5c, d-сурет). Бұл байланыстың кеңістіктік сақталуын одан әрі анықтау үшін біз P3-тен бастап примордиумды қоршаған IPR жасушаларындағы бөліну жазықтығының бағдарын өлшедік, себебі бұл аймақта P4-тен бастап ең жоғары GA сигнализация белсенділігі анықталды (4-сурет). IPR-дің P3 және P4 айналасындағы бөліну бұрыштары статистикалық тұрғыдан маңызды айырмашылықтарды көрсетпеді, дегенмен P4 айналасындағы IPR-де бүйірлік жасуша бөлінулерінің жиілігінің артуы байқалды (5j-сурет). Дегенмен, P5 айналасындағы IPR жасушаларында жасуша бөліну жазықтығының бағытындағы айырмашылық статистикалық тұрғыдан маңызды болды, көлденең жасуша бөліну жиілігі күрт артты (5j-сурет). Жалпы алғанда, бұл нәтижелер GA сигнализациясы SAM-дағы жасуша бөлінулерінің бағытын басқара алатынын көрсетеді, бұл жоғары GA сигнализациясы IPR-дегі жасуша бөлінулерінің бүйірлік бағытын тудыруы мүмкін деген алдыңғы есептерге сәйкес келеді40,41.
IPR жасушалары примордияларға емес, түйіндер аралықтарына енгізіледі деп болжануда2,42,43. IPR жасуша бөлінуінің көлденең бағыты түйіндер аралықтарында эпидермальды жасушалардың параллель бойлық қатарларының типтік ұйымдастырылуына әкелуі мүмкін. Жоғарыда сипатталған бақылауларымыз GA сигнализациясы жасуша бөліну бағытын реттеу арқылы бұл процесте рөл атқаратынын көрсетеді.
Бірнеше DELLA генінің функциясының жоғалуы конститутивті GA реакциясына әкеледі, ал della мутанттары бұл гипотезаны тексеру үшін пайдаланылуы мүмкін44. Біз алдымен SAM-дағы бес DELLA генінің экспрессия үлгілерін талдадық. GUS желісінің45 транскрипциялық бірігуі GAI, RGA, RGL1 және RGL2 (әлдеқайда аз дәрежеде) SAM-да экспрессияланғанын көрсетті (қосымша 11a–d сурет). In situ будандастыру GAI мРНҚ-ның примордияларда және дамып келе жатқан гүлдерде арнайы жинақталатынын көрсетті (қосымша 11e сурет). RGL1 және RGL3 мРНҚ SAM көлеңкесінде және ескі гүлдерде анықталды, ал RGL2 мРНҚ шекаралық аймақта көбірек болды (қосымша 11f–h сурет). pRGL3::RGL3-GFP SAM конфокальды бейнелеуі in situ будандастыруымен байқалған экспрессияны растады және RGL3 ақуызының SAM-ның орталық бөлігінде жиналатынын көрсетті (қосымша 11i сурет). pRGA::GFP-RGA сызығын пайдалана отырып, біз RGA ақуызының SAM-да жиналатынын, бірақ оның мөлшері P4-тен бастап шекарада азаятынын анықтадық (Қосымша 11j-сурет). Айта кету керек, RGL3 және RGA экспрессия үлгілері qmRGA арқылы анықталғандай, IPR-дегі жоғары GA сигнал беру белсенділігімен сәйкес келеді (4-сурет). Сонымен қатар, бұл деректер барлық DELLA-лардың SAM-да көрінетінін және олардың экспрессиясы тұтастай алғанда бүкіл SAM-ды қамтитынын көрсетеді.
Келесіде біз жабайы типті SAM (Ler, бақылау) және gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della бестік (жаһандық) мутанттарындағы жасуша бөліну параметрлерін талдадық (6a, b сурет). Қызығы, біз della global мутант SAM-да жабайы типпен салыстырғанда жасуша бөліну бұрышы жиіліктерінің таралуында статистикалық тұрғыдан маңызды өзгерісті байқадық (6c сурет). della global мутантындағы бұл өзгеріс 80–90° бұрыштар жиілігінің (34,71% vs. 24,55%) және аз дәрежеде 70–80° бұрыштардың (23,78% vs. 20,18%) артуына байланысты болды, яғни көлденең жасуша бөлінулеріне сәйкес келеді (6c сурет). Көлденең емес бөліну жиілігі (0–60°) della global мутантында да төмен болды (6c сурет). della global мутантының SAM-ында көлденең жасуша бөліну жиілігі айтарлықтай артты (6b-сурет). IPR-дегі көлденең жасуша бөліну жиілігі della global мутантында жабайы типпен салыстырғанда жоғары болды (6d-сурет). IPR аймағынан тыс жерде жабайы тип жасуша бөліну бұрыштарының біркелкі таралуына ие болды, ал della global мутант IPR сияқты тангенциалды бөлінулерді артық көрді (6e-сурет). Біз сондай-ақ GA жинақталатын GA-белсенді емес мутант фоны болып табылатын ga2 оксидаза (ga2ox) бестік мутанттарының (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 және ga2ox6-2) SAM-ында жасуша бөлінулерінің бағытын сандық түрде анықтадық. GA деңгейінің жоғарылауына сәйкес, бестік ga2ox мутант гүлшоғырының SAM-ы Col-0-ға қарағанда үлкенірек болды (қосымша 12a-сурет, b), ал Col-0-мен салыстырғанда бестік ga2ox SAM жасуша бөліну бұрыштарының айтарлықтай басқаша таралуын көрсетті, бұрыш жиілігі 50°-тан 90°-қа дейін артты, яғни тағы да тангенциалды бөлінулерге қолайлы болды (қосымша 12a–c-сурет). Осылайша, біз GA сигнализациясының конститутивті белсенділігі мен GA жинақталуы IPR-де және SAM-ның қалған бөлігінде бүйірлік жасуша бөлінулерін тудыратынын көрсетеміз.
a, b Конфокальды микроскопияны қолдана отырып, PI-боялған Ler (a) және жаһандық делла мутантының (b) SAM-ның L1 қабатының 3D визуализациясы. 10 сағаттық кезең ішінде SAM-да (бірақ примордиумда емес) пайда болған жаңа жасуша қабырғалары көрсетілген және олардың бұрыштық мәндеріне сәйкес боялған. Кірістірілген суретте 0 сағаттағы SAM көрсетілген. Түс жолағы төменгі оң жақ бұрышта көрсетілген. (b)-дағы көрсеткі жаһандық делла мутантындағы тураланған жасуша файлдарының мысалын көрсетеді. Тәжірибе ұқсас нәтижелермен екі рет қайталанды. ce Ler және жаһандық делла арасындағы бүкіл SAM (d), IPR (e) және IPR емес (f) жасуша бөліну жазықтығының бағдарларының жиілік таралуын салыстыру. P мәндері екі жақты Колмогоров-Смирнов сынағын қолдану арқылы алынды. f, g Col-0 (i) және pCUC2::gai-1-VENUS (j) трансгенді өсімдіктерінің PI-боялған SAM-ның конфокальды кескіндерінің 3D визуализациясы. (a, b) панельдері SAM-да 10 сағат ішінде пайда болған жаңа жасуша қабырғаларын (бірақ примордияларды емес) көрсетеді. Тәжірибе ұқсас нәтижелермен екі рет қайталанды. h–j Col-0 және pCUC2::gai-1-VENUS өсімдіктері арасындағы SAM (h), IPR (i) және IPR емес (j) бүкіл жасуша бөліну жазықтығындағы бағдарлардың жиілік таралуын салыстыру. P мәндері екі жақты Колмогоров-Смирнов сынағы арқылы алынды.
Келесіде біз GA сигнал беруді тежеудің әсерін IPR-де арнайы тексердік. Осы мақсатта біз VENUS-қа қосылған доминантты теріс gai-1 ақуызының экспрессиясын қоздыру үшін котиледон кесесі 2 (CUC2) промоторын қолдандық (pCUC2::gai-1-VENUS желісінде). Жабайы типтегі SAM-да CUC2 промоторы P4-тен бастап шекаралық жасушаларды қоса алғанда, SAM-дағы көптеген IPR экспрессиясын қоздырады, және ұқсас ерекше экспрессия pCUC2::gai-1-VENUS өсімдіктерінде байқалды (төменде қараңыз). pCUC2::gai-1-VENUS өсімдіктерінің SAM немесе IPR бойынша жасуша бөліну бұрыштарының таралуы жабайы типтегіден айтарлықтай ерекшеленбеді, дегенмен күтпеген жерден бұл өсімдіктерде IPR жоқ жасушалардың 80-90° жоғары жиілікте бөлінетінін анықтадық (6f-j сурет).
Жасуша бөлінуінің бағыты SAM геометриясына, атап айтқанда тін қисығы тудыратын созылу кернеуіне байланысты деген болжам жасалды46. Сондықтан біз SAM пішіні della global мутантында және pCUC2::gai-1-VENUS өсімдіктерінде өзгерген бе деп сұрадық. Бұрын хабарланғандай12, della global мутант SAM өлшемі жабайы типтегіден үлкен болды (Қосымша 13a, b, d сурет). CLV3 және STM РНҚ-ның in situ будандастыруы della мутанттарындағы меристема кеңеюін растады және бағаналы жасуша қуысының бүйірлік кеңеюін көрсетті (Қосымша 13e, f, h, i сурет). Дегенмен, SAM қисығы екі генотипте де ұқсас болды (Қосымша 13k, m, n, p сурет). Біз gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple мутантында жабайы типпен салыстырғанда қисықтық өзгеріссіз өлшемнің ұқсас өсуін байқадық (Қосымша 13c, d, g, j, l, o, p). Жасуша бөлінуінің жиілігі della quadruple мутантында да әсер етті, бірақ della monolith мутантына қарағанда аз дәрежеде (Қосымша 12d–f сурет). Бұл дозалау әсері, қисыққа әсер етпеуімен қатар, Della quadruple мутантындағы қалдық RGL3 белсенділігі DELLA белсенділігінің жоғалуынан туындаған жасуша бөлінуінің бағытындағы өзгерістерді шектейтінін және бүйірлік жасуша бөлінулеріндегі өзгерістер SAM геометриясындағы өзгерістерге емес, GA сигнал беру белсенділігінің өзгеруіне жауап ретінде болатынын көрсетеді. Жоғарыда сипатталғандай, CUC2 промоторы SAM-да IPR экспрессиясын P4-тен бастап басқарады (14a, b қосымша сурет), ал керісінше, pCUC2::gai-1-VENUS SAM өлшемі кішірейген, бірақ қисықтығы жоғары болды (14c–h қосымша сурет). pCUC2::gai-1-VENUS SAM морфологиясындағы бұл өзгеріс жабайы типпен салыстырғанда механикалық кернеулердің басқаша таралуына әкелуі мүмкін, мұнда жоғары шеңберлік кернеулер SAM орталығынан қысқа қашықтықта басталады47. Балама ретінде, pCUC2::gai-1-VENUS SAM морфологиясындағы өзгерістер трансген экспрессиясынан туындаған аймақтық механикалық қасиеттердің өзгеруінен туындауы мүмкін48. Екі жағдайда да бұл жасушалардың шеңберлік/көлденең бағытта бөліну ықтималдығын арттыру арқылы GA сигнализациясындағы өзгерістердің әсерін ішінара өтеуі мүмкін, бұл біздің бақылауларымызды түсіндіреді.
Жалпы алғанда, біздің деректеріміз жоғары GA сигнализациясының IPR-дегі жасуша бөліну жазықтығының бүйірлік бағдарында белсенді рөл атқаратынын растайды. Олар сондай-ақ меристема қисығы IPR-дегі жасуша бөліну жазықтығының бағдарына да әсер ететінін көрсетеді.
IPR-дегі бөлу жазықтығының көлденең бағыты, жоғары GA сигнал беру белсенділігіне байланысты, GA кейінірек эпидермальды түйінде кездесетін жасушалық ұйымды анықтау үшін SAM ішіндегі эпидермистегі радиалды жасуша файлын алдын ала ұйымдастыратынын көрсетеді. Шынында да, мұндай жасуша файлдары della global мутанттарының SAM суреттерінде жиі көрінді (6b-сурет). Осылайша, SAM-дағы GA сигнал берудің кеңістіктік үлгісінің даму функциясын одан әрі зерттеу үшін біз жабайы типтегі (Ler және Col-0), della global мутанттарында және pCUC2::gai-1-VENUS трансгенді өсімдіктеріндегі IPR жасушаларының кеңістіктік ұйымын талдау үшін уақыт аралығын бейнелеуді қолдандық.
Біз qmRGA IPR-дегі GA сигнал беру белсенділігінің P1/P2-ден жоғарылап, P4-ке жеткенін және бұл үлгі уақыт өте келе тұрақты болып қалғанын анықтадық (4a–f сурет және 8c–f, k қосымша сурет). GA сигналының артуымен IPR-дегі жасушалардың кеңістіктік ұйымдасуын талдау үшін біз Ler IPR жасушаларын P4-тің үстінде және бүйірлерінде олардың алғашқы бақылаудан кейін 34 сағаттан кейін талданған даму тағдырына сәйкес белгіледік, яғни екі пластидтен артық уақыт, бұл бізге P1/P2-ден P4-ке дейінгі алғашқы даму кезінде IPR жасушаларын бақылауға мүмкіндік берді. Біз үш түрлі түсті қолдандық: P4 маңындағы алғашқы жасушаға біріктірілген жасушалар үшін сары, IPR-де болғандар үшін жасыл және екі процеске де қатысқандар үшін күлгін (7a–c сурет). t0 кезінде (0 сағ) P4 алдында 1-2 IPR жасушалары көрінді (7a сурет). Күтілгендей, бұл жасушалар бөлінген кезде, олар негізінен көлденең бөлу жазықтығы арқылы бөлінді (7a–c суреттер). Ұқсас нәтижелер Col-0 SAM көмегімен алынды (P3-ке назар аудара отырып, оның шекарасы Ler-де P4-ке ұқсас бүктеледі), дегенмен бұл генотипте гүл шекарасында пайда болған бүктеме IPR жасушаларын тезірек жасырды (7g–i сурет). Осылайша, IPR жасушаларының бөліну үлгісі жасушаларды түйіндер арасындағыдай радиалды қатарларға алдын ала ұйымдастырады. Радиалды қатарлардың ұйымдастырылуы және IPR жасушаларының бірізді мүшелер арасында орналасуы бұл жасушалардың түйіндер арасындағы бастауыштар екенін көрсетеді.
Мұнда біз GA және GA рецепторларының біріктірілген концентрацияларынан туындайтын GA сигнал беру белсенділігін сандық картаға түсіруге мүмкіндік беретін, эндогендік сигнал беру жолдарына кедергіні азайта отырып, осылайша жасушалық деңгейде GA функциясы туралы ақпарат беретін қатынастық GA сигнал беру биосенсорын, qmRGA, әзірледік. Осы мақсатта біз DELLA өзара әрекеттесу серіктестерін байланыстыру қабілетін жоғалтқан, бірақ GA тудыратын протеолизге сезімтал болып қалатын модификацияланған DELLA ақуызын, mRGA, құрдық. qmRGA GA деңгейлеріндегі экзогендік және эндогендік өзгерістерге жауап береді, ал оның динамикалық сезімталдық қасиеттері даму кезінде GA сигнал беру белсенділігіндегі кеңістіктік-уақыттық өзгерістерді бағалауға мүмкіндік береді. qmRGA сонымен қатар өте икемді құрал болып табылады, себебі оны экспрессиялау үшін қолданылатын промоторды өзгерту арқылы (қажет болған жағдайда) әртүрлі тіндерге бейімдеуге болады және GA сигнал беру жолының және ангиоспермдердегі PFYRE мотивінің сақталған сипатын ескере отырып, оны басқа түрлерге беруге болады22. Осыған сәйкес, күріш SLR1 DELLA ақуызындағы (HYY497AAA) баламалы мутация SLR1 өсу репрессорлық белсенділігін басатыны, сонымен қатар оның GA арқылы жүзеге асырылатын деградациясын mRGA23-ке ұқсас аздап төмендететіні көрсетілген. Атап айтқанда, Arabidopsis-тегі жақында жүргізілген зерттеулер PFYRE доменіндегі (S474L) бір аминқышқылдық мутация RGA транскрипциялық белсенділігін транскрипция факторы серіктестерімен өзара әрекеттесу қабілетіне әсер етпестен өзгерткенін көрсетті50. Бұл мутация mRGA-да болатын 3 аминқышқылдық алмастыруларға өте жақын болса да, біздің зерттеулеріміз бұл екі мутация DELLA-ның әртүрлі сипаттамаларын өзгертетінін көрсетеді. Транскрипция факторы серіктестерінің көпшілігі DELLA26,51-дің LHR1 және SAW домендерімен байланысқанымен, PFYRE доменіндегі кейбір сақталған аминқышқылдары бұл өзара әрекеттесулерді тұрақтандыруға көмектесуі мүмкін.
Түйіндер аралық дамуы өсімдік архитектурасы мен өнімділікті арттырудағы негізгі белгі болып табылады. qmRGA IPR түйіндер аралық бастапқы жасушаларында GA сигнал беру белсенділігінің жоғары екенін анықтады. Сандық бейнелеу мен генетиканы біріктіре отырып, біз GA сигнал беру үлгілерінің SAM эпидермисінде дөңгелек/көлденең жасуша бөліну жазықтықтарын қабаттастырып, түйіндер аралық дамуы үшін қажетті жасуша бөліну ұйымын қалыптастыратынын көрсеттік. Даму кезінде жасуша бөліну жазықтығының бағытының бірнеше реттегіштері анықталды52,53. Біздің жұмысымыз GA сигнал беру белсенділігінің бұл жасушалық параметрді қалай реттейтінінің айқын мысалын келтіреді. DELLA алдын ала бүктелетін ақуыз кешендерімен әрекеттесе алады41, сондықтан GA сигнал беру кортикальды микротүтікшелердің бағытына тікелей әсер ету арқылы жасуша бөліну жазықтығының бағытын реттеуі мүмкін40,41,54,55. Біз күтпеген жерден SAM-да GA сигнал беру белсенділігінің жоғарырақ болуының корреляциясы жасушаның ұзаруы немесе бөлінуі емес, тек өсу анизотропиясы екенін көрсеттік, бұл GA-ның IPR-дегі жасуша бөліну бағытына тікелей әсерімен сәйкес келеді. Дегенмен, бұл әсердің жанама болуы мүмкін екенін де жоққа шығара алмаймыз, мысалы, GA тудырған жасуша қабырғасының жұмсаруымен56. Жасуша қабырғасының қасиеттерінің өзгеруі механикалық кернеуді тудырады57,58, бұл кортикальды микротүтікшелердің бағытына әсер ету арқылы жасуша бөліну жазықтығының бағытына да әсер етуі мүмкін39,46,59. GA тудырған механикалық кернеудің және GA арқылы микротүтікшелердің бағытын тікелей реттеудің біріккен әсерлері түйіндер аралықтарын анықтау үшін IPR-де жасуша бөліну бағытының белгілі бір үлгісін жасауға қатысуы мүмкін және бұл идеяны тексеру үшін қосымша зерттеулер қажет. Сол сияқты, алдыңғы зерттеулер түйіндер аралық түзілуін бақылауда DELLA-мен әрекеттесетін TCP14 және 15 ақуыздарының маңыздылығын атап өтті60,61 және бұл факторлар түйіндер аралық дамуын реттейтін және GA сигналына әсер ететіні көрсетілген BREVIPEDICELLUS (BP) және PENNYWISE (PNY)-мен бірге GA әсерін делдал етуі мүмкін2,62. DELL-дің брассиностероидпен, этиленмен, жасмон қышқылымен және абсциз қышқылымен (ABA) сигнал беру жолдарымен әрекеттесетінін63,64 және бұл гормондар микротүтікшелердің бағдарына65 әсер етуі мүмкін екенін ескере отырып, GA-ның жасуша бөліну бағдарына әсері басқа гормондармен де жүзеге асырылуы мүмкін.
Ерте цитологиялық зерттеулер Arabidopsis SAM-ның ішкі және сыртқы аймақтарының түйіндер аралық дамуы үшін қажет екенін көрсетті2,42. GA ішкі тіндердегі жасуша бөлінуін белсенді түрде реттейтіні12 SAM-дағы меристема мен түйіндер аралық өлшемін реттеуде GA-ның қос функциясын қолдайды. Бағытталған жасуша бөлінуінің үлгісі ішкі SAM тінінде де қатаң реттеледі және бұл реттеу сабақтың өсуі үшін маңызды52. GA ішкі SAM ұйымында жасуша бөліну жазықтығын бағдарлауда, осылайша SAM ішіндегі түйіндер спецификациясы мен дамуын синхрондауда рөл атқаратынын зерттеу қызықты болады.
Өсімдіктер in vitro топырақта немесе 1% сахароза және 1% агар (Sigma) қосылған 1x Мурашиге-Скуг (MS) ортасында (Duchefa) стандартты жағдайларда (16 сағат жарық, 22 °C) өсірілді, гипокотил және тамыр өсіру тәжірибелерін қоспағанда, көшеттер тұрақты жарық және 22 °C температурада тік тақтайшаларда өсірілді. Нитрат тәжірибелері үшін өсімдіктер ұзақ күндік жағдайларда жеткілікті нитрат (0 немесе 10 мМ KNO3), 0,5 мМ NH4-сукцинат, 1% сахароза және 1% A-агар (Sigma) қосылған модификацияланған MS ортасында (bioWORLD өсімдік ортасы) өсірілді.
pDONR221-ге енгізілген GID1a кДНҚ pUBQ10::GID1a-mCherry генерациялау үшін pB7m34GW-ге pDONR P4-P1R-pUBQ10 және pDONR P2R-P3-mCherry-мен рекомбинацияланды. pDONR221-ге енгізілген IDD2 ДНҚ p35S:IDD2-RFP генерациялау үшін pB7RWG266-ға рекомбинацияланды. pGID1b::2xmTQ2-GID1b генерациялау үшін GID1b кодтау аймағының жоғарғы жағындағы 3,9 кб фрагмент және GID1b кДНҚ (1,3 кб) мен терминаторды (3,4 кб) қамтитын 4,7 кб фрагмент алдымен 3-қосымша кестедегі праймерлерді пайдаланып күшейтілді, содан кейін сәйкесінше pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) және pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) ішіне енгізілді және соңында Gateway клондауын пайдаланып pDONR221 2xmTQ268-мен pGreen 012567 нысана векторына қайта біріктірілді. pCUC2::LSSmOrange генерациялау үшін CUC2 промотор тізбегі (ATG-ден жоғары 3229 б.п.), содан кейін N7 ядролық локализация сигналы бар үлкен Стокс-ығысқан mOrange (LSSmOrange)69 кодтау тізбегі және NOS транскрипциялық терминаторы Gateway 3-фрагменттік рекомбинация жүйесі (Invitrogen) арқылы pGreen канамицин нысаналау векторына жиналды. Өсімдіктің екілік векторы Agrobacterium tumefaciens GV3101 штаммына енгізілді және Agrobacterium инфильтрация әдісімен Nicotiana benthamiana жапырақтарына және Arabidopsis thaliana Col-0-ға гүлді батыру әдісімен енгізілді. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry және pCLV3::mCherry-NLS qmRGA сәйкес будандастырулардың F3 және F1 ұрпақтарынан бөлініп алынды.
РНҚ in situ будандастыруы шамамен 1 см ұзындықтағы өскін ұштарында жүргізілді72, олар жиналып, 4°C дейін алдын ала салқындатылған FAA ерітіндісінде (3,7% формальдегид, 5% сірке қышқылы, 50% этанол) дереу бекітілді. 2 × 15 мин вакуумдық өңдеуден кейін бекіткіш ауыстырылды және үлгілер түні бойы инкубацияланды. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 және RGL3 кДНҚ және олардың 3′-UTR-леріне антисенс зондтары Розье және т.б.73 сипаттағандай, 3-қосымша кестеде көрсетілген праймерлерді пайдаланып синтезделді. Дигоксигенинмен белгіленген зондтар дигоксигенин антиденелерін (3000 есе сұйылту; Roche, каталог нөмірі: 11 093 274 910) пайдаланып иммундық анықталды, ал кесінділер 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP, 250 есе сұйылту)/нитроблюг тетразолий (NBT, 200 есе сұйылту) ерітіндісімен боялды.
Жарияланған уақыты: 2025 жылғы 10 ақпан