Қарағай нематоды - қарағайлы орман экожүйесінде ауыр экономикалық шығындарға әкелетін карантиндік миграциялық эндопаразит. Осы зерттеуде қарағай нематодтарына қарсы галогендік индолдардың нематицидтік белсенділігі және олардың әсер ету механизмі қарастырылады. Қарағай нематодтарына қарсы 5-иодоиндол мен авермектиннің (оң бақылау) нематицидтік белсенділігі төмен концентрацияларда (10 мкг/мл) ұқсас және жоғары болды. 5-йодиндол ұрықтандыруды, репродуктивті белсенділікті, эмбриондық және дернәсілдердің өлімін және тірек-қимыл әрекетін төмендетеді. Лигандтардың омыртқасыздарға тән глутаматпен жабылған хлоридті арна рецепторларымен молекулалық өзара әрекеттесуі 5-йодиндол, авермектин сияқты, рецептордың белсенді аймағымен тығыз байланысады деген түсінікті қолдайды. 5-йодоиндол сондай-ақ нематодтарда әртүрлі фенотиптік деформацияларды тудырды, соның ішінде органның қалыптан тыс ыдырауы/жиырылуы және вакуолизацияның жоғарылауы. Бұл нәтижелер вакуольдердің нематодтардың метилденуі арқылы өлімінде рөл атқаруы мүмкін екенін көрсетеді. Маңыздысы, 5-йодиндол екі өсімдік түріне де (қырыққабат пен шалғам) улы емес болды. Осылайша, бұл зерттеу йодоиндолды қоршаған орта жағдайында қолдану қарағайдың солғын зақымдануын бақылауға болатынын көрсетеді.
Қарағай ағашы нематодтары (Bursaphelenchus xylophilus) қарағай орманының экожүйелеріне қатты экологиялық зиян келтіретіні белгілі, көшіп-қонатын эндопаразиттік нематодтар, қарағай ағашының нематодтарына (PWN) жатады1. Қарағай ағашының нематодынан туындаған қарағайдың солуы ауруы (ҚҚА) Азия мен Еуропаны қоса алғанда, бірнеше континенттерде күрделі мәселеге айналуда, ал Солтүстік Америкада нематод интродукцияланған қарағай түрлерін жояды1,2. Қарағай ағаштарының азаюы басты экономикалық проблема болып табылады және оның жаһандық таралу болашағы алаңдатады3. Қарағайдың келесі түрлері жиі нематодпен шабуылдайды: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii және Pinus radiata4. Қарағай нематоды - жұқтырғаннан кейін бірнеше апта немесе айлар ішінде қарағайларды өлтіретін ауыр ауру. Сонымен қатар, қарағай нематодының ошақтары әртүрлі экожүйелерде жиі кездеседі, сондықтан тұрақты инфекциялық тізбектер құрылған1.
Bursaphelenchus xylophilus – Aphelenchoidea супертұқымдасына және 102.5 класына жататын карантиндік өсімдік-паразиттік нематод. Нематод саңырауқұлақтармен қоректенеді және қарағай ағаштарының ағаш ұлпаларында көбейеді, төрт түрлі дернәсілдік сатыға дамиды: L1, L2, L3, L4 және ересек жеке тұлға1,6. Азық-түлік тапшылығы жағдайында қарағай нематодасы мамандандырылған дернәсілдік кезеңге – дауэрге өтіп, оның тасымалдаушысы – қарағай қабығы қоңызын (Monochamus alternatus) паразиттендіреді және сау қарағайларға көшеді. Дені сау қожайындарда нематодтар өсімдік тіндері арқылы тез көшіп, паренхиматозды жасушалармен қоректенеді, бұл инфекциядан кейін бір жыл ішінде бірқатар жоғары сезімталдық реакцияларына, қарағайдың солып кетуіне және өлімге әкеледі1,7,8.
Қарағай нематодтарымен биологиялық күрес ұзақ уақыт бойы қиын болды, карантиндік шаралар 20 ғасырдан басталады. Қарағай нематодтарымен күресудің қазіргі стратегиялары ең алдымен химиялық өңдеулерді, соның ішінде ағашты фумигациялауды және ағаш діңіне нематицидтерді имплантациялауды қамтиды. Ең жиі қолданылатын нематицидтер - авермектиндер тұқымдасына жататын авермектин және авермектин бензоат. Бұл қымбат химиялық заттар нематодтардың көптеген түрлеріне қарсы жоғары тиімді және экологиялық қауіпсіз болып саналады9. Алайда, бұл нематицидтерді қайталап қолдану селекциялық қысымды тудырады деп күтілуде, бұл төзімді қарағай нематодтарының пайда болуына әкеліп соғады, бұл Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella және Trichostrongylus colubriformis және Ostertaciagia циркуляциялық төзімділігі дамыған нематодтар сияқты бірнеше жәндік зиянкестер үшін көрсетілгендей. авермектиндер10,11,12. Сондықтан PVD-мен күресу үшін балама, үнемді және экологиялық таза шараларды табу үшін қарсылық үлгілерін жүйелі түрде зерттеп, нематицидтерді үздіксіз скринингтен өткізу қажет. Соңғы онжылдықтарда бірқатар авторлар нематодтармен күресетін агенттер ретінде өсімдік сығындыларын, эфир майларын және ұшпа заттарды пайдалануды ұсынды13,14,15,16.
Жақында біз Caenorhabditis elegans 17-де жасуша аралық және патшалық сигнал беретін молекуласы индолдың нематицидтік белсенділігін көрсеттік. Индол микробтық экологияда кең таралған жасушаішілік сигнал болып табылады, микробтардың физиологиясына, спора түзілуіне, плазмидтердің тұрақтылығына, дәрілік заттарға төзімділігіне, биофильмнің түзілуіне және вируленттілікке әсер ететін көптеген функцияларды бақылайды 18, 19. Индолдың және оның туындыларының басқа патогендік нематодтарға қарсы белсенділігі зерттелмеген. Бұл зерттеуде біз 34 индолдың қарағай нематодтарына қарсы нематицидтік белсенділігін зерттедік және микроскопия, уақытша фотосурет және молекулалық қондыру эксперименттерін пайдалана отырып, ең күшті 5-иодоиндолдың әсер ету механизмін түсіндірдік және тұқымның өнуін талдау арқылы оның өсімдіктерге уытты әсерін бағаладық.
Индолдың жоғары концентрациясы (>1,0 мМ) нематодтарға нематицидтік әсер ететіні туралы бұрын хабарланған17. B. xylophilus (аралас тіршілік кезеңдері) индолмен немесе 33 түрлі индол туындыларымен 1 мМ-де өңдеуден кейін B. xylophilus өлімі бақылау және өңделген топтардағы тірі және өлі нематодтарды санау арқылы өлшенді. Бес индол маңызды нематицидтік белсенділікті көрсетті; өңделмеген бақылау тобының өмір сүруі 24 сағаттан кейін 95 ± 7% құрады. Сынақталған 34 индолдың ішінде 1 мм-де 5-йодиндол және 4-фториндол 100% өлімге әкелді, ал 5,6-дифториндиго, метилиндол-7-карбоксилат және 7-йодиндол шамамен 50% өлімге әкелді (1-кесте).
5-йодиндолдың вакуоль түзілуіне және қарағай ағашы нематодының метаболизміне әсері. (A) Авермектин мен 5-йодиндолдың ересек аталық нематодтарға әсері, (B) L1 сатыдағы нематод жұмыртқалары және (C) B. xylophilus метаболизмі, (i) вакуольдер 0 сағатта байқалмады, емдеу нәтижесінде (ii) вакуольдер, (iii) вакуольдер, (iii) вакуольдердің жиналуы, көптеген вакуольдердің (вакуольдердің) жиналуы вакуольдердің қосылуы және (vi) алып вакуольдердің түзілуі. Қызыл көрсеткілер вакуольдердің ісінуін, көк көрсеткілер вакуольдердің бірігуін және қара көрсеткілер алып вакуольдерді көрсетеді. Масштаб жолағы = 50 мкм.
Сонымен қатар, бұл зерттеу қарағай нематодтарындағы метан-индукциялық өлімнің дәйекті процесі де сипатталған (4С-сурет). Метаногендік өлім - бұл көрнекті цитоплазмалық вакуольдердің жиналуымен байланысты жасуша өлімінің апоптотикалық емес түрі27. Қарағай нематодтарында байқалатын морфологиялық ақаулар метанның әсерінен өлу механизмімен тығыз байланысты. Әртүрлі уақыттағы микроскопиялық зерттеу 5-йодиндол (0,1 мМ) әсер еткенде 20 сағаттан кейін алып вакуольдердің пайда болғанын көрсетті. Микроскопиялық вакуольдер емдеуден кейін 8 сағаттан кейін байқалды, олардың саны 12 сағаттан кейін өсті. 14 сағаттан кейін бірнеше үлкен вакуольдер байқалды. Бірнеше біріктірілген вакуольдер емдеуден кейін 12-16 сағаттан кейін анық көрінді, бұл вакуоль синтезі метаногендік өлім механизмінің негізі екенін көрсетеді. 20 сағаттан кейін құрттың бойынан бірнеше алып вакуольдер табылды. Бұл бақылаулар C. elegans метуозының алғашқы есебін білдіреді.
5-йодиндолмен өңделген құрттарда да вакуольдердің агрегациясы және жарылуы байқалды (5-сурет), бұл құрттың иілісі мен қоршаған ортаға вакуольдің бөлінуінен көрінеді. Жұмыртқа қабығының жарғақшасында да вакуольдің бұзылуы байқалды, ол әдетте инкубация кезінде L2 арқылы бүтін сақталады (қосымша S2 сурет). Бұл бақылаулар сұйықтықтың жиналуының және осморегуляцияның бұзылуының, сондай-ақ жасушаның қайтымды зақымдануының (RCI) вакуольді қалыптастыру және іріңдеу процесіне қатысуын қолдайды (5-сурет).
Бақыланатын вакуоль түзілуіндегі йодтың рөлі туралы гипотеза жасай отырып, біз натрий йодидінің (NaI) және калий йодидінің (KI) нематицидтік белсенділігін зерттедік. Алайда, концентрацияларда (0,1, 0,5 немесе 1 мМ) олар нематодтардың тіршілігіне де, вакуольдің түзілуіне де әсер еткен жоқ (Қосымша S5 сурет), бірақ 1 мМ KI аздап нематицидтік әсер етті. Екінші жағынан, 7-иодоиндол (1 немесе 2 мМ), 5-йодиндол сияқты, көптеген вакуольдер мен құрылымдық деформацияларды тудырды (қосымша S6 сурет). Екі йодоиндол қарағай нематодтарында ұқсас фенотиптік сипаттарды көрсетті, ал NaI және KI жоқ. Бір қызығы, сыналған концентрацияларда индол B. xylophilus-да вакуоль түзілуін индукциялаған жоқ (деректер көрсетілмеген). Осылайша, нәтижелер индол-йод кешені B. xylophilus вакуолизациясы мен метаболизміне жауапты екенін растады.
Нематицидтік белсенділікке сыналған индолдардың ішінде 5-йодиндол ең жоғары сырғу индексіне ие болды -5,89 ккал/моль, одан кейін 7-йодиндол (-4,48 ккал/моль), 4-фториндол (-4,33) және индол (-4,03) (6-сурет). 5-йодиндолдың лейцин 218-мен күшті магистральдық сутегі байланысы оның байланысуын тұрақтандырады, ал барлық басқа индол туындылары бүйірлік тізбекті сутегі байланыстары арқылы серин 260-пен байланысады. Басқа модельденген йодоиндолдар арасында 2-йодоиндолдың байланысу мәні -5,248 ккал/моль, бұл оның лейцин 218-мен негізгі сутегі байланысына байланысты. Басқа белгілі байланыстарға 3-йодоиндол (-4,3 ккал/моль), 4-йодоиндол (-4,0 ккал/моль) (-4,0 ккал/моль) жатады. ккал/моль) (қосымша S8 сурет). Көптеген галогенделген индолдар мен индолдың өзі, 5-йодоиндол мен 2-йодииндолды қоспағанда, серин 260-мен байланыс түзеді. лейцин 218-мен сутегі байланысы ивермектин үшін байқалғандай рецепторлар-лигандтардың тиімді байланысуының көрсеткіші болып табылады (Қосымша Figiodoindol). 2-йодиндол, ивермектин сияқты, лейцин 218 арқылы GluCL рецепторының белсенді аймағымен тығыз байланысады (6-сурет және қосымша сурет S8). Біз бұл байланыстыру GluCL кешенінің ашық кеуекті құрылымын сақтау үшін қажет және GluCL рецепторының белсенді аймағына, 5-иодоиндол, 2-иодоиндол, авермектин және ивермектинге тығыз байланыстыру арқылы иондық арнаны ашық ұстап тұру және сұйықтықты қабылдауға мүмкіндік беруді ұсынамыз.
Индол мен галогенделген индолдың GluCL-ге молекулалық қосылуы. (A) индолдың, (B) 4-фториндолдың, (С) 7-йодиндолдың және (D) 5-йодиндол лигандтарының GluCL белсенді аймағына байланысу бағдарлары. Ақуыз таспамен, ал магистральдық сутегі байланыстары сары нүктелі сызықтармен көрсетілген. (A'), (B'), (C') және (D') сәйкес лигандтардың қоршаған аминқышқылдарының қалдықтарымен әрекеттесуін көрсетеді, ал бүйірлік тізбекті сутектік байланыстар қызғылт нүктелі көрсеткілермен көрсетілген.
Қырыққабат пен шалғам тұқымдарының өнуіне 5-йодиндолдың токсикалық әсерін бағалау үшін тәжірибелер жүргізілді. 5-йодиндол (0,05 немесе 0,1 мМ) немесе авермектин (10 мкг/мл) бастапқы өну мен өсімдіктің шығуына аз немесе мүлдем әсер еткен жоқ (7-сурет). Сонымен қатар, өңделмеген бақылаулар мен 5-йодиндол немесе авермектинмен өңделген тұқымдардың өну жылдамдығы арасында айтарлықтай айырмашылық табылған жоқ. 1 мМ (оның белсенді концентрациясы 10 есе) 5-йодиндолдың бүйірлік тамырлардың дамуын сәл кешіктіргенімен, тамырдың ұзаруына және түзілген бүйір тамырлар санына әсері шамалы болды. Бұл нәтижелер 5-йодиндолдың өсімдік жасушалары үшін уытты емес екенін және зерттелген концентрацияларда өсімдіктің даму процестеріне кедергі жасамайтынын көрсетеді.
5-йодиндолдың тұқымның өнуіне әсері. B. oleracea және R. raphanistrum тұқымдарының авермектин немесе 5-йодидоиндол бар немесе онсыз Мурашиге және Скоог агары қоректік орталарында өнуі, өнуі және бүйірден тамырлануы. Өндіру 22°C температурада 3 күн инкубациядан кейін тіркелді.
Бұл зерттеу нематодтарды индолдармен өлтірудің бірнеше жағдайларын хабарлайды. Маңыздысы, бұл йодоиндолдың коммерциялық нематицидтік қасиетке ұқсас маңызды нематицидтік қасиеттерін көрсететін қарағай инелеріндегі йодоиндолды индукциялайтын метилдену (үлкен вакуольдерге біртіндеп қосылатын, сайып келгенде мембрананың жарылуы мен өліміне әкелетін шағын вакуольдердің жиналуынан туындаған процесс) туралы бірінші есеп.
Индолдар прокариоттар мен эукариоттарда көптеген сигналдық функцияларды орындайды, соның ішінде биофильмді тежеу/түзу, бактериялардың өмір сүруі және патогенділігі 19,32,33,34. Жақында галогенделген индолдардың, индол алкалоидтарының және жартылай синтетикалық индол туындыларының потенциалды емдік әсерлері ғылыми зерттеулерде үлкен қызығушылық тудырды35,36,37. Мысалы, галогенді индолдар тұрақты ішек таяқшасы мен алтын стафилококк жасушаларын өлтіретіні көрсетілген37. Сонымен қатар, галогенді индолдардың басқа түрлерге, тектерге және патшалықтарға қарсы тиімділігін зерттеу ғылыми қызығушылық тудырады және бұл зерттеу осы мақсатқа жету жолындағы қадам болып табылады.
Мұнда біз қайтымды жасуша жарақатына (RCI) және метилденуге (4C және 5-суреттер) негізделген C. elegans-те 5-йодиндолмен туындаған өлімге әкелетін механизмді ұсынамыз. Ісіну және вакуольді дегенерация сияқты ісіну өзгерістері цитоплазмадағы алып вакуольдер түрінде көрінетін RCI және метилдену көрсеткіштері болып табылады48,49. RCI ATP өндірісін азайту, ATPase сорғысының істен шығуын тудыруы немесе жасуша мембраналарының бұзылуын тудыруы және Na+, Ca2+ және судың жылдам ағынын тудыруы арқылы энергия өндірісіне кедергі жасайды50,51,52. Са2+ және су53 ағынының әсерінен цитоплазмада сұйықтықтың жиналуы нәтижесінде жануарлар жасушаларында интрацитоплазмалық вакуольдер пайда болады. Бір қызығы, егер зақымдану уақытша болса және жасушалар белгілі бір уақыт ішінде АТФ өндіре бастаса, жасуша зақымдануының бұл механизмі қайтымды болады, бірақ егер зақымдану сақталса немесе нашарласа, жасушалар өледі.54 Біздің бақылауларымыз көрсеткендей, 5-йодиндолмен өңделген нематодтар стресстік жағдайларға ұшырағаннан кейін қалыпты биосинтезді қалпына келтіре алмайды.
B. xylophilus-те 5-йодиндол индукциялаған метилдену фенотипі йодтың болуына және оның молекулалық таралуына байланысты болуы мүмкін, өйткені 7-йодиндол B. xylophilus-ке 5-иодоиндолға қарағанда аз тежегіш әсер етті (1-кесте және қосымша S6 сурет). Бұл нәтижелер Maltese және т.б. зерттеулерімен ішінара сәйкес келеді. (2014), олар индолдағы пиридил азот бөлігінің пара-позициядан мета-позицияға ауысуы U251 жасушаларында вакуолизацияны, өсуді тежеуді және цитотоксикалықты жойды, бұл молекуланың ақуыздағы белгілі бір белсенді сайтпен өзара әрекеттесуінің маңызды екенін көрсетеді27,44,45. Осы зерттеуде байқалған индол немесе галогенделген индолдар мен GluCL рецепторлары арасындағы өзара әрекеттесу де бұл түсінікті қолдайды, өйткені 5- және 2-йодиндол GluCL рецепторларымен зерттелген басқа индолдарға қарағанда күштірек байланысатыны анықталды (6-сурет және қосымша S8 сурет). Индолдың екінші немесе бесінші позициясындағы йод магистральдық сутегі байланыстары арқылы GluCL рецепторының лейцин 218-мен байланысатыны анықталды, ал басқа галогенделген индолдар мен индолдың өзі 260 серинмен әлсіз бүйірлік тізбекті сутектік байланыстарды құрайды (6-сурет). Сондықтан галогеннің локализациясы вакуолярлық дегенерацияның индукциясында маңызды рөл атқарады деп болжаймыз, ал 5-йодиндолдың тығыз байланысуы иондық арнаны ашық ұстайды, осылайша сұйықтықтың жылдам ағыны мен вакуольдің жарылуына мүмкіндік береді. Дегенмен, 5-йодиндолдың егжей-тегжейлі әсер ету механизмін анықтау қажет.
5-йодиндолды тәжірибе жүзінде қолданар алдында оның өсімдіктерге улы әсерін талдау керек. Тұқымның өнуіне жүргізген тәжірибелеріміз 5-йодиндолдың зерттелген концентрацияларда тұқымның өнуіне немесе одан кейінгі даму процестеріне теріс әсер етпейтінін көрсетті (7-сурет). Осылайша, бұл зерттеу қарағай нематодтарының қарағай ағаштарына зияндылығын бақылау үшін экологиялық ортада 5-йодиндолды қолдануға негіз береді.
Алдыңғы есептер индол негізіндегі терапия антибиотиктерге төзімділік пен қатерлі ісіктің өршуі мәселесін шешудің әлеуетті тәсілі болып табылатынын көрсетті55. Сонымен қатар, индолдар бактерияға қарсы, ісікке қарсы, антиоксиданттық, қабынуға қарсы, диабетке қарсы, вирусқа қарсы, пролиферацияға қарсы және туберкулезге қарсы белсенділікке ие және дәрілік заттардың дамуы үшін перспективалы негіз бола алады56,57. Бұл зерттеу алғаш рет йодты антипаразиттік және антигельминтикалық агент ретінде қолдану мүмкіндігін ұсынады.
Авермектин осыдан үш онжылдық бұрын ашылып, 2015 жылы Нобель сыйлығын жеңіп алды және оны антигельминтикалық дәрі ретінде пайдалану әлі де белсенді түрде жалғасуда. Дегенмен, нематодтар мен жәндіктер зиянкестерінде авермектиндерге төзімділіктің жылдам дамуына байланысты қарағайлардағы PWN инфекциясымен күресудің баламалы, арзан және экологиялық таза стратегиясы қажет. Бұл зерттеу сонымен қатар 5-йодиндолдың қарағай нематодтарын өлтіретін механизмі туралы және 5-йодиндолдың өсімдік жасушаларына төмен уыттылығы туралы хабарлайды, бұл оның болашақ коммерциялық қолданылуына жақсы перспективалар ашады.
Барлық эксперименттерді Йунгнам университетінің Этика комитеті, Кёнсан, Корея мақұлдады және әдістер Еунгнам университетінің Этика комитетінің нұсқауларына сәйкес орындалды.
Жұмыртқаны инкубациялау эксперименттері белгіленген процедуралар арқылы орындалды43. Инкубация жылдамдығын (HR) бағалау үшін 1 күндік ересек нематодтар (шамамен 100 аналық және 100 аталық) саңырауқұлақтары бар Петри табақшаларына ауыстырылды және 24 сағат бойы өсуіне рұқсат етілді. Содан кейін жұмыртқалар оқшауланып, стерильді тазартылған суда суспензия ретінде 5-йодиндолмен (0,05 мМ және 0,1 мМ) немесе авермектинмен (10 мкг/мл) өңделді. Бұл суспензиялар (500 мкл; шамамен 100 жұмыртқа) 24 шұңқырлы тіндерді өсіретін пластинаның ұңғымаларына ауыстырылды және 22 °C температурада инкубацияланды. L2 саны инкубациядан кейін 24 сағаттан кейін жасалды, бірақ егер жасушалар жұқа платина сымымен ынталандырылған кезде қозғалмаса, өлі деп саналады. Бұл тәжірибе екі кезеңде, әрқайсысы алты қайталаумен жүргізілді. Екі тәжірибенің деректері біріктіріліп, ұсынылды. HR пайызы келесідей есептеледі:
Дернәсілдердің өлімі бұрын әзірленген процедуралар арқылы бағаланды. Нематодтардың жұмыртқалары жиналды және эмбриондар L2 сатысының личинкаларын жасау үшін стерильді тазартылған суда инкубациялау арқылы синхрондалды. Синхронды дернәсілдер (шамамен 500 нематод) 5-йодиндолмен (0,05 мМ және 0,1 мМ) немесе авермектинмен (10 мкг/мл) өңделіп, B. cinerea Петри табақшаларында өсірілді. 22 °C температурада 48 сағат инкубациядан кейін нематодтар стерильді тазартылған суға жиналды және L2, L3 және L4 кезеңдерінің болуын зерттеді. L3 және L4 кезеңдерінің болуы дернәсілдің өзгеруін көрсетті, ал L2 кезеңінің болуы трансформацияның жоқтығын көрсетті. Суреттер iRiS™ сандық ұяшықты бейнелеу жүйесі арқылы алынды. Бұл тәжірибе екі кезеңде, әрқайсысы алты қайталаумен жүргізілді. Екі тәжірибенің деректері біріктіріліп, ұсынылды.
Тұқымға 5-иодоиндол мен авермектиннің уыттылығы Мурашиге және Скоог агар пластиналарындағы өну сынақтары арқылы бағаланды.62 B. oleracea және R. raphanistrum тұқымдары алдымен бір күн бойы стерильді тазартылған суға малынған, 1 мл 100% тауарлық этанолмен жуылған, сондықтан 1 мл 100% тауарлық этанолмен, стерилденген% 1 мл50 гипохлорит) 15 мин, және бес рет 1 мл стерильді сумен жуылады. Содан кейін зарарсыздандырылған тұқымдар құрамында 0,86 г/л (0,2X) Мурашиге және Скоог ортасы және 5-йодоиндол немесе авермектин бар немесе онсыз 0,7% бактериологиялық агар бар өну агары пластинкаларына басылды. Содан кейін пластиналар 22 °C температурада инкубацияланды және суреттер 3 күн инкубациядан кейін алынды. Бұл тәжірибе екі кезеңде жүргізілді, олардың әрқайсысында алты қайталану болды.
Жіберу уақыты: 26 ақпан 2025 ж