Қарағай нематодасы - қарағай ормандарының экожүйелерінде үлкен экономикалық шығындарға әкелетіні белгілі карантиндік миграциялық эндопаразит. Бұл зерттеуде галогенделген индолдардың қарағай нематодтарына қарсы нематоцидтік белсенділігі және олардың әсер ету механизмі қарастырылады. 5-йодоиндол мен авермектиннің (оң бақылау) қарағай нематодтарына қарсы нематоцидтік белсенділігі ұқсас және төмен концентрацияларда (10 мкг/мл) жоғары болды. 5-йодоиндол ұрықтануды, репродуктивті белсенділікті, эмбриондық және дернәсілдердің өлімін және қозғалыс әрекетін төмендетті. Лигандтардың омыртқасыздарға тән глутаматпен жабылған хлоридті канал рецепторларымен молекулалық өзара әрекеттесуі 5-йодоиндолдың, авермектин сияқты, рецептордың белсенді орталығына тығыз байланысатыны туралы пікірді растайды. 5-йодоиндол сонымен қатар нематодтарда әртүрлі фенотиптік деформацияларды, соның ішінде аномальды мүшелердің құлауын/кішірейуін және вакуолизацияның жоғарылауын тудырды. Бұл нәтижелер вакуольдердің нематодтың метилденуіне байланысты өлімінде рөл атқаруы мүмкін екенін көрсетеді. Маңыздысы, 5-йодоиндол екі өсімдік түріне де (қырыққабат және шалқан) улы емес болды. Осылайша, бұл зерттеу йодоиндолды қоршаған орта жағдайында қолдану қарағайдың солуының зақымдануын бақылауға болатынын көрсетеді.
Қарағай орманының нематодасы (Bursaphelenchus xylophilus) қарағай орманының нематодтарына (PWN) жатады, бұл қарағай орманының экожүйелеріне ауыр экологиялық зиян келтіретіні белгілі миграциялық эндопаразитті нематодтар1. Қарағай орманының нематодынан туындаған қарағайдың солу ауруы (PWD) Азия мен Еуропаны қоса алғанда бірнеше құрлықта күрделі мәселеге айналуда, ал Солтүстік Америкада нематод енгізілген қарағай түрлерін жояды1,2. Қарағай ағаштарының азаюы ірі экономикалық мәселе болып табылады және оның жаһандық таралу мүмкіндігі алаңдатарлық3. Нематодтың шабуылына көбінесе келесі қарағай түрлері ұшырайды: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii және Pinus radiata4. Қарағай нематодасы - инфекциядан кейін бірнеше апта немесе ай ішінде қарағай ағаштарын өлтіруі мүмкін ауыр ауру. Сонымен қатар, қарағай нематодының өршуі әртүрлі экожүйелерде жиі кездеседі, сондықтан тұрақты инфекция тізбектері анықталды1.
Bursaphelenchus xylophilus - Aphelenchoidea супертуысына және 102.5 кладына жататын карантиндік өсімдік-паразиттік нематод. Нематод саңырауқұлақтармен қоректенеді және қарағай ағаштарының ағаш тіндерінде көбейеді, төрт түрлі дернәсіл сатысына дамиды: L1, L2, L3, L4 және ересек дара1,6. Азық-түлік тапшылығы жағдайында қарағай нематодасы мамандандырылған дернәсіл сатысына - dauer сатысына өтеді, ол өзінің тасымалдаушысы - қарағай қабығы қоңызын (Monochamus alternatus) паразиттік етеді және сау қарағай ағаштарына ауысады. Сау иелерде нематодтар өсімдік тіндері арқылы тез қозғалады және паренхиматозды жасушалармен қоректенеді, бұл инфекциядан кейін бір жыл ішінде бірқатар аса сезімталдық реакцияларына, қарағайдың солуына және өліміне әкеледі1,7,8.
Қарағай нематодтарын биологиялық жолмен бақылау ұзақ уақыт бойы қиындық тудырды, карантиндік шаралар 20 ғасырдан бері бар. Қарағай нематодтарын бақылаудың қазіргі стратегиялары негізінен ағашты фумигациялау және ағаш діңдеріне нематоцидтерді имплантациялауды қоса алғанда, химиялық өңдеуді қамтиды. Ең жиі қолданылатын нематоцидтер - авермектин тұқымдасына жататын авермектин және авермектин бензоаты. Бұл қымбат химиялық заттар көптеген нематод түрлеріне қарсы өте тиімді және экологиялық таза деп саналады9. Дегенмен, бұл нематоцидтерді қайталап қолдану төзімді қарағай нематодтарының пайда болуына әкелетін іріктеу қысымын тудырады деп күтілуде, бұл Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella және Trichostrongylus colubriformis және Ostertagia circumcincta сияқты бірнеше жәндік зиянкестеріне біртіндеп төзімділік танытқаны дәлелденген10,11,12. Сондықтан, PVD-ны бақылаудың балама, тиімді және экологиялық таза шараларын табу үшін төзімділік үлгілерін үнемі зерттеп, нематоцидтерді үздіксіз тексеріп отыру қажет. Соңғы онжылдықтарда бірқатар авторлар өсімдік сығындыларын, эфир майларын және ұшпа заттарды нематодтарды бақылау агенттері ретінде пайдалануды ұсынды13,14,15,16.
Жақында біз Caenorhabditis elegans 17-де жасушааралық және патшалықтар арасындағы сигнал беру молекуласы индолдың нематоцидтік белсенділігін көрсеттік. Индол микробтық экологияда кең таралған жасушаішілік сигнал болып табылады, микробтық физиологияға, спора түзілуіне, плазмиданың тұрақтылығына, дәрілік төзімділікке, биоүлбір түзілуіне және вируленттілікке әсер ететін көптеген функцияларды басқарады 18, 19. Индол мен оның туындыларының басқа патогенді нематодтарға қарсы белсенділігі зерттелмеген. Бұл зерттеуде біз 34 индолдың қарағай нематодтарына қарсы нематоцидтік белсенділігін зерттеп, микроскопия, уақыттық фотосурет және молекулалық докинг эксперименттерін қолдана отырып, ең күшті 5-йодоиндолдың әсер ету механизмін анықтадық және тұқымның өнуін талдау арқылы өсімдіктерге оның уытты әсерін бағаладық.
Индолдың жоғары концентрациясы (>1,0 мМ) бұрын нематодтарға нематоцидтік әсер ететіні туралы хабарланған17. B. xylophilus (аралас өмірлік кезеңдері) индолмен немесе 1 мМ концентрацияда 33 түрлі индол туындыларымен өңдегеннен кейін, B. xylophilus өлімі бақылау және емделген топтардағы тірі және өлі нематодтарды санау арқылы өлшенді. Бес индол айтарлықтай нематоцидтік белсенділік көрсетті; емделмеген бақылау тобының өмір сүру деңгейі 24 сағаттан кейін 95 ± 7% құрады. Сыналған 34 индолдың ішінде 1 мМ концентрацияда 5-йодоиндол және 4-фтороиндол 100% өлімге әкелді, ал 5,6-дифториндиго, метилиндол-7-карбоксилат және 7-йодоиндол шамамен 50% өлімге әкелді (1-кесте).
5-йодоиндолдың қарағай нематодының вакуоль түзілуіне және метаболизміне әсері. (A) Авермектин мен 5-йодоиндолдың ересек аталық нематодтарға әсері, (B) L1 сатысындағы нематод жұмыртқалары және (C) B. xylophilus метаболизмі, (i) 0 сағат ішінде вакуольдер байқалмады, емдеу нәтижесінде (ii) вакуольдер, (iii) бірнеше вакуольдердің жиналуы, (iv) вакуольдердің ісінуі, (v) вакуольдердің бірігуі және (vi) алып вакуольдердің пайда болуы байқалды. Қызыл көрсеткілер вакуольдердің ісінуін, көк көрсеткілер вакуольдердің бірігуін, ал қара көрсеткілер алып вакуольдерді көрсетеді. Масштаб жолағы = 50 мкм.
Сонымен қатар, бұл зерттеу қарағай нематодтарында метаннан туындаған өлімнің тізбекті процесін де сипаттады (4C сурет). Метаногендік өлім - көрнекті цитоплазмалық вакуольдердің жиналуымен байланысты жасуша өлімінің апоптоздық емес түрі27. Қарағай нематодтарында байқалған морфологиялық ақаулар метаннан туындаған өлім механизмімен тығыз байланысты болып көрінеді. Әртүрлі уақыттағы микроскопиялық зерттеу 5-йодоиндолға (0,1 мМ) 20 сағат әсер еткеннен кейін алып вакуольдердің пайда болғанын көрсетті. Микроскопиялық вакуольдер 8 сағат өңдеуден кейін байқалды, ал олардың саны 12 сағаттан кейін артты. 14 сағаттан кейін бірнеше үлкен вакуольдер байқалды. 12-16 сағат өңдеуден кейін бірнеше біріккен вакуольдер айқын көрінді, бұл вакуольдердің бірігуі метаногендік өлім механизмінің негізі екенін көрсетеді. 20 сағаттан кейін құрт бойымен бірнеше алып вакуольдер табылды. Бұл бақылаулар C. elegans-тегі метуоздың алғашқы есебін білдіреді.
5-йодоиндолмен өңделген құрттарда вакуольдердің агрегациясы мен жарылуы да байқалды (5-сурет), бұл құрттардың майысуы және қоршаған ортаға вакуольдердің бөлінуі арқылы көрінеді. Вакуольдердің бұзылуы жұмыртқа қабығының мембранасында да байқалды, ол әдетте жұмыртқадан шыққан кезде L2 арқылы бүтін күйінде сақталады (қосымша S2-сурет). Бұл бақылаулар сұйықтықтың жиналуы мен осморегуляциялық бұзылыстың, сондай-ақ қайтымды жасуша зақымдануының (RCI) вакуольдің пайда болуы мен іріңдеуі процесіне қатысуын растайды (5-сурет).
Байқалған вакуоль түзілуіндегі йодтың рөлін болжап, біз натрий йодидінің (NaI) және калий йодидінің (KI) нематоцидтік белсенділігін зерттедік. Дегенмен, концентрацияларда (0,1, 0,5 немесе 1 мМ) олар нематодтың тіршілігіне немесе вакуольдің түзілуіне әсер еткен жоқ (S5 қосымша сурет), дегенмен 1 мМ KI аздап нематоцидтік әсер етті. Екінші жағынан, 7-йодоиндол (1 немесе 2 мМ), 5-йодоиндол сияқты, бірнеше вакуольдер мен құрылымдық деформацияларды тудырды (S6 қосымша сурет). Екі йодоиндол қарағай нематодтарында ұқсас фенотиптік сипаттамаларды көрсетті, ал NaI және KI көрсетпеді. Қызығы, индол тексерілген концентрацияларда B. xylophilus-та вакуольдің түзілуін тудырмады (деректер көрсетілмеген). Осылайша, нәтижелер индол-йод кешенінің B. xylophilus вакуолизациясы мен метаболизміне жауапты екенін растады.
Нематоцидтік белсенділігі тексерілген индолдардың ішінде 5-йодоиндолдың ең жоғары сырғанау индексі -5,89 ккал/моль болды, одан кейін 7-йодоиндол (-4,48 ккал/моль), 4-фтороиндол (-4,33) және индол (-4,03) келеді (6-сурет). 5-йодоиндолдың лейцин 218-мен күшті негізгі сутектік байланысы оның байланысуын тұрақтандырады, ал басқа барлық индол туындылары серин 260-пен бүйірлік тізбекті сутектік байланыстар арқылы байланысады. Басқа модельденген йодоиндолдардың ішінде 2-йодоиндолдың байланыс мәні -5,248 ккал/моль құрайды, бұл оның лейцинмен негізгі сутектік байланысына байланысты 218. Басқа белгілі байланыстарға 3-йодоиндол (-4,3 ккал/моль), 4-йодоиндол (-4,0 ккал/моль) және 6-фтороиндол (-2,6 ккал/моль) жатады (S8 қосымша сурет). 5-йодоиндол мен 2-йодоиндолдан басқа, галогенденген индолдардың көпшілігі және индолдың өзі серин 260-пен байланыс түзеді. Лейцин 218-мен сутектік байланыс тиімді рецептор-лиганд байланысын көрсетеді, бұл ивермектин үшін байқалады (S7 қосымша сурет), 5-йодоиндол мен 2-йодоиндолдың, ивермектин сияқты, лейцин 218 арқылы GluCL рецепторының белсенді орталығына тығыз байланысатынын растайды (6-сурет және S8 қосымша сурет). Біз бұл байланыс GluCL кешенінің ашық кеуекті құрылымын сақтау үшін қажет деп болжаймыз және GluCL рецепторының белсенді орталығына тығыз байланысып, 5-йодоиндол, 2-йодоиндол, авермектин және ивермектин иондық каналды ашық ұстап, сұйықтықтың сіңуіне мүмкіндік береді.
Индол мен галогенденген индолдың GluCL-ге молекулалық қосылуы. (A) индол, (B) 4-фториндол, (C) 7-йодоиндол және (D) 5-йодоиндол лигандтарының GluCL белсенді орталығына байланысу бағыттары. Ақуыз таспамен көрсетілген, ал негізгі сутектік байланыстар сары нүктелі сызықтармен көрсетілген. (A′), (B′), (C′) және (D′) сәйкес лигандтардың қоршаған аминқышқылдарының қалдықтарымен әрекеттесуін көрсетеді, ал бүйірлік тізбекті сутектік байланыстар қызғылт нүктелі көрсеткілермен көрсетілген.
5-йодоиндолдың қырыққабат пен шалғам тұқымдарының өнуіне уытты әсерін бағалау үшін тәжірибелер жүргізілді. 5-йодоиндол (0,05 немесе 0,1 мМ) немесе авермектин (10 мкг/мл) бастапқы өну мен өсімдіктің шығуына аз әсер етті немесе мүлдем әсер етпеді (7-сурет). Сонымен қатар, өңделмеген бақылау тұқымдары мен 5-йодоиндолмен немесе авермектинмен өңделген тұқымдардың өну жылдамдығы арасында айтарлықтай айырмашылық табылған жоқ. Тамырдың ұзаруына және пайда болған бүйірлік тамырлар санына әсері елеусіз болды, дегенмен 1 мМ (оның белсенді концентрациясынан 10 есе көп) 5-йодоиндол бүйірлік тамырлардың дамуын сәл кешіктірді. Бұл нәтижелер 5-йодоиндолдың өсімдік жасушалары үшін улы емес екенін және зерттелген концентрацияларда өсімдіктердің даму процестеріне кедергі келтірмейтінін көрсетеді.
5-йодоиндолдың тұқымның өнуіне әсері. Мурашиге және Скуг агар ортасында авермектин немесе 5-йодоиндол қосылған немесе онсыз B. oleracea және R. raphanistrum тұқымдарының өнуі, өнуі және бүйірлік тамырлануы. Өну 22°C температурада 3 күн инкубациядан кейін тіркелді.
Бұл зерттеуде индолдардың нематодтарды өлтіруінің бірнеше жағдайы туралы айтылады. Маңыздысы, бұл қарағай инелерінде йодоиндолдың метилденуін (кішкентай вакуольдердің жиналуынан туындайтын процесс, олар біртіндеп алып вакуольдерге бірігеді, ақырында мембраналардың жарылуына және өліміне әкеледі) тудыратыны туралы алғашқы есеп, йодоиндол коммерциялық нематоцид авермектинге ұқсас маңызды нематоцидтік қасиеттер көрсетеді.
Индолдардың прокариоттар мен эукариоттарда биофильмнің тежелуі/түзілуі, бактериялардың тіршілік етуі және патогенділігі сияқты көптеген сигнал беру функцияларын атқаратыны туралы бұрын хабарланған болатын19,32,33,34. Жақында галогенделген индолдардың, индол алкалоидтарының және жартылай синтетикалық индол туындыларының әлеуетті терапиялық әсерлері кең көлемді зерттеу қызығушылығын тудырды35,36,37. Мысалы, галогенделген индолдардың тұрақты Escherichia coli және Staphylococcus aureus жасушаларын өлтіретіні көрсетілген37. Сонымен қатар, галогенделген индолдардың басқа түрлерге, туыстарға және патшалықтарға қарсы тиімділігін зерттеу ғылыми қызығушылық тудырады және бұл зерттеу осы мақсатқа жету жолындағы қадам болып табылады.
Мұнда біз C. elegans жасушаларында 5-йодоиндол тудыратын өлімге әкелетін механизмді қайтымды жасуша зақымдануы (RCI) және метилденуге негізделген ұсынамыз (4C және 5-суреттер). Ісіну және вакуолярлық дегенерация сияқты ісіну өзгерістері RCI және метилденудің көрсеткіштері болып табылады, олар цитоплазмада алып вакуольдер ретінде көрінеді48,49. RCI АТФ өндірісін азайту, АТФаза сорғысының істен шығуына немесе жасуша мембраналарын бұзып, Na+, Ca2+ және судың тез ағынын тудыру арқылы энергия өндірісіне кедергі келтіреді50,51,52. Жануар жасушаларында Ca2+ және судың ағынына байланысты цитоплазмада сұйықтықтың жиналуы нәтижесінде цитоплазмаішілік вакуольдер пайда болады53. Қызығы, жасуша зақымдануының бұл механизмі қайтымды, егер зақым уақытша болса және жасушалар белгілі бір уақыт ішінде АТФ өндіре бастаса, бірақ зақым жалғасса немесе күшейсе, жасушалар өледі.54 Біздің бақылауларымыз 5-йодоиндолмен өңделген нематодтардың стресстік жағдайларға ұшырағаннан кейін қалыпты биосинтезді қалпына келтіре алмайтынын көрсетеді.
B. xylophilus-та 5-йодоиндол тудыратын метилдену фенотипі йодтың болуына және оның молекулалық таралуына байланысты болуы мүмкін, себебі 7-йодоиндол B. xylophilus-қа 5-йодоиндолға қарағанда аз ингибиторлық әсер етті (1-кесте және S6 қосымша сурет). Бұл нәтижелер Maltese және т.б. (2014) зерттеулерімен ішінара сәйкес келеді, олар индолдағы пиридил азот бөлігінің пара- позициядан мета- позицияға транслокациясы U251 жасушаларында вакуолизацияны, өсудің тежелуін және цитотоксикалықты жоятынын хабарлады, бұл молекуланың ақуыздағы белгілі бір белсенді орталықпен әрекеттесуінің маңызды екенін көрсетеді27,44,45. Бұл зерттеуде байқалған индол немесе галогенденген индолдар мен GluCL рецепторлары арасындағы өзара әрекеттесулер де бұл пікірді растайды, өйткені 5- және 2-йодоиндол зерттелген басқа индолдарға қарағанда GluCL рецепторларымен күштірек байланысатыны анықталды (6-сурет және S8 қосымша сурет). Индолдың екінші немесе бесінші позициясындағы йодтың GluCL рецепторының лейцині 218-мен негізгі сутектік байланыстар арқылы байланысатыны анықталды, ал басқа галогенденген индолдар және индолдың өзі серин 260-пен әлсіз бүйірлік тізбекті сутектік байланыстар түзеді (6-сурет). Сондықтан галогеннің локализациясы вакуолярлық дегенерацияны индукциялауда маңызды рөл атқарады деп болжаймыз, ал 5-йодоиндолдың тығыз байланысуы иондық арнаны ашық ұстайды, осылайша сұйықтықтың тез ағынына және вакуольдің жарылуына мүмкіндік береді. Дегенмен, 5-йодоиндолдың әсер ету механизмі әлі анықталмаған.
5-йодоиндолды практикалық қолданар алдында оның өсімдіктерге уытты әсерін талдау қажет. Біздің тұқымның өнуіне жүргізілген тәжірибелеріміз 5-йодоиндолдың зерттелген концентрацияларда тұқымның өнуіне немесе кейінгі даму процестеріне теріс әсер етпегенін көрсетті (7-сурет). Осылайша, бұл зерттеу қарағай нематодтарының қарағай ағаштарына зияндылығын бақылау үшін экологиялық ортада 5-йодоиндолды қолдануға негіз береді.
Алдыңғы есептер индолға негізделген терапия антибиотиктерге төзімділік және қатерлі ісіктің өршуі мәселесін шешудің әлеуетті тәсілі екенін көрсетті55. Сонымен қатар, индолдар бактерияға қарсы, қатерлі ісікке қарсы, антиоксидантты, қабынуға қарсы, диабетке қарсы, вирусқа қарсы, пролиферативті және туберкулезге қарсы белсенділікке ие және дәрі-дәрмектерді әзірлеу үшін перспективалы негіз бола алады56,57. Бұл зерттеу алғаш рет йодты паразиттерге қарсы және антигельминтикалық агент ретінде қолдану мүмкіндігін ұсынады.
Авермектин үш онжылдық бұрын ашылып, 2015 жылы Нобель сыйлығын жеңіп алды, ал оны антигельминтикалық дәрі ретінде қолдану әлі де белсенді түрде жалғасуда. Дегенмен, нематодтар мен зиянкес жәндіктерде авермектиндерге төзімділіктің тез дамуына байланысты қарағай ағаштарындағы PWN инфекциясын бақылау үшін балама, арзан және экологиялық таза стратегия қажет. Бұл зерттеуде сонымен қатар 5-йодоиндолдың қарағай нематодтарын қалай өлтіретіні және 5-йодоиндолдың өсімдік жасушаларына уыттылығы төмен екендігі туралы айтылады, бұл оны болашақта коммерциялық қолдану үшін жақсы мүмкіндіктер ашады.
Барлық тәжірибелер Кореяның Кёнсан қаласындағы Ёнгнам университетінің Этика комитетімен мақұлданды және әдістер Ёнгнам университетінің Этика комитетінің нұсқауларына сәйкес орындалды.
Жұмыртқа инкубациясы бойынша тәжірибелер белгіленген процедураларды қолдана отырып жүргізілді43. Инкубация жылдамдығын (HR) бағалау үшін 1 күндік ересек нематодтар (шамамен 100 аналық және 100 аталық) саңырауқұлақ бар Петри ыдыстарына ауыстырылып, 24 сағат бойы өсіруге мүмкіндік берді. Содан кейін жұмыртқалар бөлініп алынып, стерильді дистилденген суда суспензия ретінде 5-йодоиндолмен (0,05 мМ және 0,1 мМ) немесе авермектинмен (10 мкг/мл) өңделді. Бұл суспензиялар (500 мкл; шамамен 100 жұмыртқа) 24 ұяшықты тін дақылы пластинасының ұяшықтарына ауыстырылып, 22 °C температурада инкубацияланды. L2 санау 24 сағаттық инкубациядан кейін жүргізілді, бірақ егер жасушалар жұқа платина сымымен ынталандырылған кезде қозғалмаса, өлі деп саналды. Бұл тәжірибе екі кезеңде жүргізілді, әрқайсысы алты рет қайталанды. Екі тәжірибенің де деректері біріктіріліп, ұсынылды. HR пайызы келесідей есептеледі:
Дернәсілдердің өлімі бұрын жасалған процедураларды қолдану арқылы бағаланды. Нематода жұмыртқалары жиналып, эмбриондар L2 сатысындағы дернәсілдерді алу үшін стерильді дистилденген суда шығу арқылы синхрондалды. Синхрондалған дернәсілдер (шамамен 500 нематода) 5-йодоиндолмен (0,05 мМ және 0,1 мМ) немесе авермектинмен (10 мкг/мл) өңделіп, B. cinerea Petri пластинкаларында өсірілді. 22 °C температурада 48 сағат инкубациядан кейін нематодалар стерильді дистилденген суда жиналып, L2, L3 және L4 сатыларының бар-жоғы тексерілді. L3 және L4 сатыларының болуы дернәсілдердің трансформациясын көрсетті, ал L2 сатысының болуы трансформацияның жоқтығын көрсетті. Суреттер iRiS™ сандық жасуша бейнелеу жүйесін пайдаланып алынды. Бұл тәжірибе екі кезеңде, әрқайсысы алты қайталаумен жүргізілді. Екі тәжірибенің де деректері біріктіріліп, ұсынылды.
5-йодоиндол мен авермектиннің тұқымдарға уыттылығы Мурашиге және Скуг агар тақталарындағы өну сынақтарын қолдану арқылы бағаланды.62 B. oleracea және R. raphanistrum тұқымдары алдымен бір күн бойы стерильді дистилденген суға салынды, 1 мл 100% этанолмен жуылды, 1 мл 50% коммерциялық ағартқышпен (3% натрий гипохлориті) 15 минут бойы стерильденді және 1 мл стерильді сумен бес рет жуылды. Содан кейін стерильденген тұқымдар 0,86 г/л (0,2X) Мурашиге және Скуг ортасы және 0,7% бактериологиялық агары бар өну агары тақталарына басылды, олар 5-йодоиндол немесе авермектинмен немесе онсыз. Содан кейін тақталар 22 °C температурада инкубацияланды, ал суреттер 3 күн инкубациядан кейін түсірілді. Бұл тәжірибе екі кезеңде жүргізілді, олардың әрқайсысы алты рет қайталанды.
Жарияланған уақыты: 2025 жылғы 26 ақпан