Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рақмет. Сіз пайдаланып отырған браузер нұсқасында CSS қолдауы шектеулі. Ең жақсы нәтижелерге қол жеткізу үшін браузеріңіздің жаңа нұсқасын пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer бағдарламасында үйлесімділік режимін өшіріңіз). Сонымен қатар, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильдеусіз немесе JavaScriptсіз көрсетіп жатырмыз.
Табиғи өнімдерді ашу және тиімді пайдалану адам өмірін жақсартуға көмектеседі. Өсімдіктердің өсуін тежейтін химиялық заттар арамшөптерді бақылау үшін гербицидтер ретінде кеңінен қолданылады. Әртүрлі гербицидтерді қолдану қажеттілігіне байланысты жаңа әсер ету механизмдері бар қосылыстарды анықтау қажеттілігі туындайды. Бұл зерттеуде біз Streptomyces werraensis MK493-CF1-ден жаңа N-алкоксипиррол қосылысын, кумамонамидті таптық және толық синтез процесін анықтадық. Биологиялық белсенділік талдаулары арқылы біз урс-моноамид қышқылының урс-моноамидтің синтетикалық аралық өнімі және әлеуетті екенін анықтадық.өсімдік өсу ингибиторыСонымен қатар, біз HeLa жасушаларының өсуіне теріс әсер етпестен жоғары гербицидтік белсенділікке ие урбенилокси туындысын (UDA) қоса алғанда, әртүрлі урбенон қышқылының туындыларын әзірледік. Сондай-ақ, біз урмотон қышқылының туындыларының өсімдік микротүтікшелерін бұзатынын анықтадық; сонымен қатар, KAND актин жіпшелеріне әсер етеді және жасуша өлімін тудырады; Бұл көп қырлы әсерлер белгілі микротүтікше ингибиторларынан ерекшеленеді және урсон қышқылының жаңа әсер ету механизмін ұсынады, бұл жаңа гербицидтерді әзірлеуде маңызды артықшылық болып табылады.
Пайдалы табиғи өнімдер мен олардың туындыларын ашу және практикалық қолдану адам өмірінің сапасын жақсарту құралы болып табылады. Микроорганизмдер, өсімдіктер мен жәндіктер шығаратын екінші реттік метаболиттер медицина мен ауыл шаруашылығында үлкен жетістіктерге әкелді. Табиғи өнімдерден көптеген антибиотиктер мен лейкемияға қарсы препараттар жасалды. Сонымен қатар, әртүрлі түрлеріпестицидтер, фунгицидтер мен гербицидтер ауыл шаруашылығында пайдалану үшін осы табиғи өнімдерден алынады. Атап айтқанда, арамшөптерге қарсы гербицидтер қазіргі заманғы ауыл шаруашылығында дақылдардың өнімділігін арттырудың маңызды құралдары болып табылады және әртүрлі қосылыс түрлері қазірдің өзінде коммерциялық мақсатта қолданылады. Өсімдіктердегі фотосинтез, аминқышқылдарының метаболизмі, жасуша қабырғасының синтезі, митозды реттеу, фитогормон сигнализациясы немесе ақуыз синтезі сияқты бірнеше жасушалық процестер гербицидтердің типтік нысаналары болып саналады. Микротүтікшелердің қызметін тежейтін қосылыстар митоздық реттеуге әсер ету арқылы өсімдіктердің өсуіне әсер ететін гербицидтердің кең таралған класы болып табылады2.
Микротүтікшелер цитоскелеттің құрамдас бөліктері болып табылады және эукариоттық жасушаларда кеңінен сақталады. Тубулиннің гетеродимери сызықтық микротүтікше протофиламенттерін құрайтын α-тубулин мен β-тубулиннен тұрады, ал 13 протофиламент цилиндрлік құрылымды құрайды. Микротүтікшелер өсімдік жасушаларында жасуша пішінін, жасушаның бөлінуін және жасушаішілік тасымалдауды анықтауды қоса алғанда, бірнеше рөл атқарады3,4. Өсімдік жасушаларында фазааралық плазмалық мембрананың астында микротүтікшелер болады, және бұл кортикальды микротүтікшелер целлюлоза синтаза кешендерінің реттелуі арқылы целлюлоза микрофибриллаларының ұйымдастырылуын басқарады деп есептеледі4,5. Тамыр ұшының тез ұзару аймағында орналасқан түбір эпидермальды жасушалардың кортикальды микротүтікшелері бүйірлік орналасқан, ал целлюлоза микроталшықтары осы микротүтікшелерді бақылайды және жасушаның кеңею бағытын шектейді, осылайша анизотропты жасушаның ұзаруына ықпал етеді. Сондықтан микротүтікшелердің қызметі өсімдік морфологиясымен тығыз байланысты. Тубулинді кодтайтын гендердегі аминқышқылдарының орын басулары Arabidopsis 6,7-де кортикальды микротүтікшелер массивтерінің қисаюына және солға немесе оңға өсуіне әкеледі. Сол сияқты, микротүтікшелер динамикасын реттейтін микротүтікшелермен байланысты ақуыздардағы мутациялар тамыр өсуінің бұрмалануына әкелуі мүмкін8,9,10,11,12,13. Сонымен қатар, претилахлор деп те аталатын дисопирамид сияқты микротүтікшелерді бұзатын гербицидтермен емдеу де солға қиғаш тамыр өсуіне әкеледі14. Бұл деректер микротүтікшелер функциясын дәл реттеу өсімдіктің өсу бағытын анықтау үшін өте маңызды екенін көрсетеді.
Микротүтікше ингибиторларының әртүрлі түрлері ашылды, және бұл препараттар цитоскелеттік зерттеулерге, сондай-ақ ауыл шаруашылығы мен медицинаға айтарлықтай үлес қосты2. Атап айтқанда, оризалин, динитроанилин қосылыстары, дизопирамид, бензамидке байланысты қосылыстар және олардың аналогтары микротүтікшелердің қызметін тежеп, осылайша өсімдіктердің өсуін тежеуі мүмкін. Сондықтан олар гербицидтер ретінде кеңінен қолданылады. Дегенмен, микротүтікшелер өсімдік және жануар жасушаларының маңызды құрамдас бөлігі болғандықтан, микротүтікше ингибиторларының көпшілігі екі жасуша түріне де цитотоксикалық әсер етеді. Сондықтан, олардың гербицид ретінде танылған пайдалылығына қарамастан, практикалық мақсаттарда шектеулі мөлшерде антимикротүтікше агенттері қолданылады.
Streptomyces - Streptomyces тұқымдасына жататын, аэробты, грам-позитивті, жіпшелі бактерияларды қамтитын және кең ауқымды екінші реттік метаболиттерді өндіру қабілетімен танымал. Сондықтан ол жаңа биологиялық белсенді табиғи өнімдердің ең маңызды көздерінің бірі болып саналады. Ағымдағы зерттеуде біз Streptomyces werraensis MK493-CF1 және S. werraensis ISP 5486-дан бөлініп алынған кумамонамид деп аталатын жаңа қосылысты аштық. Спектрлік талдау және толық спектрлік талдауды қолдана отырып, кумамонамидтің құрылымы сипатталды және оның бірегей N-алкоксипиррол қаңқасы анықталды. синтезі. Урсмон қышқылы, урсмонамидтің және оның туындыларының синтетикалық аралық өнімі, танымал модельдік өсімдігі Arabidopsis thaliana-ның өсуі мен өнуін тежейтіні анықталды. Құрылым-белсенділік қатынасын зерттеуде біз урсон қышқылына модификацияланған C9 бар, урсон қышқылының нонилоксидті туындысы (KAND) деп аталатын қосылыстың өсу мен өнуге тежеу әсерін айтарлықтай күшейтетінін анықтадық. Атап айтқанда, жаңадан ашылған өсімдік өсу ингибиторы темекі мен бауыр шырынының өсуіне де әсер етті және бактерияларға немесе HeLa жасушаларына цитотоксикалық әсер етпеді. Сонымен қатар, кейбір урмотон қышқылының туындылары бұрмаланған түбір фенотипін тудырады, бұл туындылардың микротүтікшелерге тікелей немесе жанама әсер ететінін білдіреді. Осы идеяға сәйкес, иммуногистохимиялық немесе флуоресцентті ақуыздармен белгіленген микротүтікшелерді бақылауымыз KAND емі микротүтікшелерді деполимерлейтінін көрсетеді. Сонымен қатар, кумамотон қышқылының туындыларымен емдеу актин микрофиламенттерін бұзды. Осылайша, біз ерекше әсер ету механизмі цитоскелеттің бұзылуын қамтитын жаңа өсімдік өсу ингибиторын аштық.
Токиодағы Шинагава-ку қаласында топырақтан MK493-CF1 штамы бөлініп алынды. MK493-CF1 штамы жақсы тармақталған стромальды мицелий түзді. 16S рибосомалық РНҚ генінің (1422 bp) ішінара тізбегі анықталды. Бұл штамм S. werraensis-ке өте ұқсас (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: типтік штамм, 99,93%). Осы нәтижеге сүйене отырып, бұл штамм S. werraensis типтік штаммымен тығыз байланысты екені анықталды. Сондықтан біз бұл штаммды уақытша S. werraensis MK493-CF1 деп атадық. S. werraensis ISP 5486T да дәл осындай биоактивті қосылыстарды шығарады. Бұл микроорганизмнен табиғи өнімдер алу бойынша алғашқы зерттеулер аз болғандықтан, одан әрі химиялық зерттеулер жүргізілді. S. werraensis MK493-CF1 арпа ортасында 30°C температурада 14 күн бойы қатты күйдегі ашыту арқылы өсірілгеннен кейін, орта 50% EtOH-пен экстракцияланды. 59,5 мг шикі экстракт алу үшін 60 мл үлгі кептірілді. Шикі экстракт N-метокси-1H-пиррол-2-карбоксамид (1, кумамонамид деп аталады, 36,0 мг) алу үшін кері фазалы HPLC-ге ұшырады. 1-дің жалпы мөлшері шикі экстракттың шамамен 60%-ын құрайды. Сондықтан біз кумамотоамид 1-дің қасиеттерін егжей-тегжейлі зерттеуді шештік.
Кумамонамид 1 - ақ аморфты ұнтақ және жоғары ажыратымдылықтағы масс-спектрометрия (HRESIMS) C6H8N2O2 растайды (1-сурет). Бұл қосылыстың C2-орынбасқан пиррол фрагменті δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Гц, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H ЯМР спектрінде: 4.5 Гц, H-5) және δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Гц, H-6) сипатталады, ал 13C ЯМР спектрінде төрт sp2 көміртек атомының болуы көрсетілген. C2 позициясында амид тобының болуы δC 161.1 температурада C-3 протонынан амид карбонилді көміртегіне HMBC корреляциясы арқылы бағаланды. Сонымен қатар, δH 4.10 (3H, S) және δC 68.3 кезінде 1 H және 13C ЯМР шыңдары молекулада N-метокси топтарының бар екенін көрсетеді. Метокси тобының дұрыс орналасуы әлі спектроскопиялық талдау, мысалы, күшейтілген айырмашылық спектроскопиясы және ядролық Overhauser аббревиатурасы (NOEDF) арқылы анықталмағанымен, N-метокси-1H-пиррол-2-карбоксамид алғашқы кандидат қосылыс болды.
1-дің дұрыс құрылымын анықтау үшін толық синтез жүргізілді (2a-сурет). Саудада қолжетімді 2-аминопиридин 2-ні m-CPBA-мен өңдеу нәтижесінде сандық шығымы сәйкес келетін N-оксид 3 алынды. 2-нің 2-аминоазидациясынан кейін, Абрамович сипаттаған циклоконденсация реакциясы бензолда 90°C температурада жүргізіліп, қажетті 1-гидрокси-1H-пиррол-2-карбонитрил 5 грамммен алынды. Жылдамдығы 60% (екі саты). 15,16. Содан кейін 4-тің метилденуі және гидролизі жақсы шығымы бар 1-метокси-1H-пиррол-2-карбон қышқылын («кумототон қышқылы» деп аталады, 6) берді (70%, екі саты). Соңында, сулы аммиакты қолдана отырып, қышқыл хлоридті аралық 6 арқылы амидациялау Кумамото амидіне 98% шығымы берді. Синтезделген 1-дің барлық спектрлік деректері оқшауланған 1-ге ұқсас болды, сондықтан 1-дің құрылымы анықталды;
Урбенамид пен урбен қышқылының биологиялық белсенділігінің жалпы синтезі және талдауы. (a) Кумамото амидінің толық синтезі. (b) Жеті күндік жабайы типті Arabidopsis Columbia (Col) көшеттері көрсетілген концентрацияларда кумамонамид 6 немесе кумамонамид 1 бар Мурашиге және Скуг (MS) тақталарында өсірілді. Масштаб жолағы = 1 см.
Алдымен, біз урбенамид пен оның аралық өнімдерінің өсімдік өсуін модуляциялау қабілетіне қарай биологиялық белсенділігін бағаладық. Біз MS агар ортасына әртүрлі концентрациядағы урсмонамид 1 немесе урсмон қышқылы 6 қосып, осы ортада Arabidopsis thaliana көшеттерін өсірдік. Бұл талдаулар 6-ның жоғары концентрациялары (500 мкМ) тамырдың өсуін тежейтінін көрсетті (2b-сурет). Әрі қарай, біз 6-ның N1 позициясын ауыстыру арқылы әртүрлі туындыларды генерацияладық және оларда құрылым-белсенділік байланысын зерттедік (аналогтық синтез процесі қосымша ақпаратта (SI) сипатталған). Arabidopsis көшеттері 50 мкМ урсон қышқылы туындылары бар ортада өсірілді және тамыр ұзындығы суретте көрсетілгендей өлшенді. 3a, b және S1 суреттерінде көрсетілгендей, кумамо қышқылдарының N1 позициясында сызықтық алкокси тізбектерінің (9, 10, 11, 12 және 13) немесе үлкен алкокси тізбектерінің (15, 16 және 17) әртүрлі ұзындықтары бар. Туындылар тамырдың өсуін айтарлықтай тежегенін көрсетті. Сонымен қатар, біз 200 мкМ 10, 11 немесе 17 қолдану өнуді тежейтінін анықтадық (3c және S2 суреттері).
Кумамото амидінің және онымен байланысты қосылыстардың құрылымдық-белсенділік байланысын зерттеу. (a) Аналогтардың құрылымы және синтез схемасы. (b) 50 мкМ кумамонамид туындылары бар немесе жоқ MS ортасында өсірілген 7 күндік көшеттердің тамыр ұзындығын сандық анықтау. Жұлдызшалар жалған өңдеумен (t-тест, p) айтарлықтай айырмашылықтарды көрсетеді.<0,05). n>18. Деректер орташа ± SD ретінде көрсетілген. nt «сыналмаған» дегенді білдіреді, себебі тұқымдардың 50%-дан астамы өнбеген. (c) 200 мкМ кумамонамид және онымен байланысты қосылыстары бар немесе онсыз MS ортасында 7 күн инкубацияланған өңделген тұқымдардың өну жылдамдығын сандық бағалау. Жұлдызшалар жалған өңдеумен (хи-квадрат сынағы) айтарлықтай айырмашылықтарды көрсетеді. n=96.
Бір қызығы, C9-дан ұзын алкилді бүйір тізбектерін қосу тежеу белсенділігін төмендетті, бұл кумамоай қышқылымен байланысты қосылыстардың биологиялық белсенділігін көрсету үшін белгілі бір өлшемдегі бүйір тізбектері қажет екенін көрсетеді.
Құрылым-белсенділік қатынасын талдау C9 урсон қышқылына өзгертілгенін және урсон қышқылының нонилокси туындысы (бұдан әрі KAND 11 деп аталады) өсімдік өсуінің ең тиімді ингибиторы екенін көрсеткендіктен, біз KAND 11-дің егжей-тегжейлі сипаттамасын жүргіздік. Arabidopsis-ті 50 мкМ KAND 11-мен өңдеу өнуді толығымен дерлік тоқтатты, ал KAND 11-дің төмен концентрациясы (40, 30, 20 немесе 10 мкМ) тамырдың өсуін дозаға тәуелді түрде тежеді (4a, b сурет). KAND 11 тамыр меристемасының тіршілік ету қабілетіне әсер ететінін тексеру үшін біз пропидий йодидімен (PI) боялған тамыр меристемаларын зерттеп, меристема ауданының өлшемін өлшедік. 25 мкМ KAND-11 бар ортада өсірілген көшеттердің меристемасының өлшемі 151,1 ± 32,5 мкм болды, ал DMSO бар бақылау ортасында өсірілген көшеттердің меристемасының өлшемі 264,7 ± 30,8 мкм болды (4c, d сурет), бұл KAND-11 жасушалық белсенділікті қалпына келтіретінін көрсетеді. таралу. Тамыр меристемасы. Осыған сәйкес, KAND 11 емі түбір меристемасында CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS жасуша бөліну маркерінің мөлшерін азайтты (4e сурет) 17. Бұл нәтижелер KAND 11 жасуша пролиферациясы белсенділігін төмендету арқылы тамырдың өсуін тежейтінін көрсетеді.
Урбенон қышқылы туындыларының (урбенилокси туындыларының) өсуге тежеуші әсерін талдау. (a) KAND 11 көрсетілген концентрациясы бар MS пластиналарында өсірілген 7 күндік жабайы типті Col көшеттері. Масштаб жолағы = 1 см. (b) Тамыр ұзындығын сандық бағалау. Әріптер маңызды айырмашылықтарды көрсетеді (Tukey HSD сынағы, p<0,05). n>16. Деректер орташа ± SD ретінде көрсетілген. (c) 25 мкМ KAND бар немесе жоқ MS пластиналарында өсірілген пропидий йодидімен боялған жабайы типті Col тамырларының конфокальды микроскопиясы. 11. Ақ жақшалар түбір меристемасын көрсетеді. Масштаб жолағы = 100 мкм. (d) Түбір меристемасының өлшемін сандық анықтау (n = 10-нан 11-ге дейін). Статистикалық айырмашылықтар t-тест (p) көмегімен анықталды.< 0,05). Жолақтар меристеманың орташа өлшемін көрсетеді. (e) CDKB2 құрылымын қамтитын түбір меристеманың дифференциалды интерференциялық контраст (DIC) микроскопиясы; 1pro: CDKB2; 25 мкМ KAND талдауымен немесе онсыз MS пластиналарында өсірілген 5 күндік көшеттерге 1-GUS боялған және боялған.
KAND 11 фитотоксикалық әсері тағы бір қосжарнақты өсімдік, темекі (Nicotiana tabacum) және негізгі құрлық өсімдіктерінің модельдік организмі, бауырқұлақ (Marchantia polymorpha) арқылы одан әрі тексерілді. Arabidopsis жағдайындағыдай, 25 мкМ KAND 11 бар ортада өсірілген темекі SR-1 көшеттері қысқа тамырлар берді (5a-сурет). Сонымен қатар, 48 тұқымның 40-ы 200 мкМ KAND 11 бар пластиналарда өніп шықты, ал барлық 48 тұқым макетпен өңделген ортада өніп шықты, бұл KAND жоғары концентрациясының маңызды екенін көрсетеді (p< 0,05; хи сынағы -шаршы) темекінің өнуін тежеді. (5b-сурет). Сонымен қатар, бауыр шырынындағы бактериялардың өсуін тежейтін KAND 11 концентрациясы Arabidopsis-тегі тиімді концентрацияға ұқсас болды (5c-сурет). Бұл нәтижелер KAND 11 әртүрлі өсімдіктердің өсуін тежей алатынын көрсетеді. Содан кейін біз аю моноамидіне байланысты қосылыстардың басқа организмдердегі, атап айтқанда, адам HeLa жасушаларындағы және Escherichia coli DH5α штаммындағы ықтимал цитоуыттылығын жоғары жануарлар мен бактерия жасушаларының өкілдері ретінде зерттедік. Жасуша пролиферациясын талдау сериясында біз кумамонамид 1, кумамонамид қышқылы 6 және KAND 11 100 мкМ концентрациясында HeLa немесе E. coli жасушаларының өсуіне әсер етпегенін байқадық (5d,e-сурет).
Arabidopsis емес организмдерде KAND 11 өсуінің тежелуі. (a) Екі апталық жабайы типті SR-1 темекі көшеттері 25 мкМ KAND 11 бар тігінен орналастырылған MS тақталарында өсірілді. (b) Екі апталық жабайы типті SR-1 темекі көшеттері 200 мкМ KAND 11 бар көлденең орналастырылған MS тақталарында өсірілді. (c) Көрсетілген KAND 11 концентрациясы бар Gamborg B5 тақталарында өсірілген екі апталық жабайы типті Tak-1 бауыр құртының бүршіктері. Қызыл көрсеткілер екі апталық инкубация кезеңінде өсуін тоқтатқан спораларды көрсетеді. (d) HeLa жасушаларының жасуша көбеюін талдау. Тіршілікке қабілетті жасушалар саны 8 жасуша санау жинағын (Dojindo) пайдаланып белгіленген уақыт аралықтарында өлшенді. Бақылау ретінде HeLa жасушалары РНҚ полимераза транскрипциясын тежейтін және жасуша өлімін тудыратын 5 мкг/мл актиномицин D (D актісі) препаратымен өңделді. Талдаулар үш рет орындалды. (e) E. coli жасушаларының көбеюін талдау. E. coli өсуі OD600 өлшеу арқылы талданды. Бақылау ретінде жасушаларға бактериялық жасуша қабырғасының синтезін тежейтін 50 мкг/мл ампициллин (Amp) енгізілді. Талдаулар үш рет орындалды.
Урамидке байланысты қосылыстардан туындаған цитотоксикалық әсер ету механизмін түсіну үшін біз орташа тежегіш әсері бар урбен қышқылының туындыларын қайта талдадық, бұл суретте көрсетілгендей. 2b, 6a суреттерінде көрсетілгендей, урмотон қышқылының 6 жоғары концентрациясы (200 мкМ) бар агар пластиналарында өсірілген көшеттер қысқа және солға иілген тамырлар берді (θ = – 23,7 ± 6,1), ал бақылау ортасында өсірілген көшеттер түзу тамырлар берді (θ = – 3,8 ± 7,1). Бұл тән қиғаш өсу кортикальды микротүтікшелердің дисфункциясынан туындайтыны белгілі14,18. Осы тұжырымға сәйкес, микротүтікшелерді тұрақсыздандыратын дизопирамид және оризалин препараттары біздің өсу жағдайларымызда тамырдың ұқсас қисаюын тудырды (2b, 6a суреттер). Сонымен қатар, біз урмотон қышқылының туындыларын тексеріп, белгілі бір концентрацияларда қиғаш тамырдың өсуін тудырған бірнешеуін таңдадық. 8, 9 және 15 қосылыстары сәйкесінше 75 мкМ, 50 мкМ және 40 мкМ кезінде тамырдың өсу бағытын өзгертті, бұл қосылыстардың микротүтікшелерді тиімді түрде тұрақсыздандыра алатынын көрсетеді (2b, 6a сурет). Біз сондай-ақ ең күшті урсол қышқылының туындысы KAND 11-ді төмен концентрацияда (15 мкМ) сынап көрдік және KAND 11 қолдану тамырдың өсуін тежейтінін және тамырдың өсу бағыты біркелкі емес екенін анықтадық, дегенмен олар солға қарай еңкейген (C3 сурет). Микротүтікшелерді тұрақсыздандыратын дәрілердің жоғары концентрациясы кейде тамырдың қисаюына әкелудің орнына өсімдіктің өсуін тежейтіндіктен, кейіннен тамыр эпидермальды жасушаларындағы кортикальды микротүтікшелерді бақылау арқылы KAND 11 микротүтікшелерге әсер ету мүмкіндігін бағаладық. 25 мкМ KAND 11 препаратымен өңделген көшет тамырларының эпидермальды жасушаларында антиβ-тубулин антиденелерін қолдана отырып жүргізілген иммуногистохимия созылу аймағындағы эпидермальды жасушалардағы барлық дерлік кортикальды микротүтікшелердің жойылып кеткенін көрсетті (6b-сурет). Бұл нәтижелер кумамотон қышқылы мен оның туындылары микротүтікшелерге тікелей немесе жанама түрде әсер етіп, оларды бұзатынын және бұл қосылыстардың жаңа микротүтікше ингибиторлары екенін көрсетеді.
Урсон қышқылы және оның туындылары Arabidopsis thaliana өсімдігіндегі кортикальды микротүтікшелерді өзгертеді. (a) Көрсетілген концентрацияларда әртүрлі урмотон қышқылы туындыларының қатысуымен өлшенген тамырдың көлбеу бұрышы. Микротүтікшелерді тежейтіні белгілі екі қосылыстың: дизопирамид пен оризалиннің әсері де талданды. Қосымшада тамырдың өсу бұрышын өлшеу үшін қолданылатын стандарт көрсетілген. Жұлдызшалар жалған емдеумен (t-тест, p) айтарлықтай айырмашылықтарды көрсетеді.<0,05). n>19. Масштаб жолағы = 1 см. (b) Созылу аймағындағы эпидермальды жасушалардағы кортикальды микротүтікшелер. 25 мкМ KAND 11 бар немесе жоқ MS пластиналарында өсірілген жабайы типті Arabidopsis Col тамырларындағы микротүтікшелер β-тубулиндік бастапқы антиденелер мен Alexa Fluor-конъюгацияланған екінші реттік антиденелерді қолдана отырып, иммуногистохимиялық бояу арқылы көрінді. Масштаб жолағы = 10 мкм. (c) Түбір меристемасында микротүтікшелердің митоздық құрылымы. Микротүтікшелер иммуногистохимиялық бояу арқылы көрінді. Профаза аймақтарын, ұршықшаларды және фрагмопласттарды қоса алғанда, митоздық құрылымдар конфокальды кескіндерден саналды. Көрсеткілер митоздық микротүтікше құрылымдарын көрсетеді. Жұлдызшалар жалған емдеумен (t-тест, p) айтарлықтай айырмашылықтарды көрсетеді.<0,05). n>9. Масштаб жолағы = 50 мкм.
Ursa микротүтікшелердің қызметін бұзу қабілетіне ие болғанымен, оның әсер ету механизмі әдеттегі микротүтікше деполимерлеуші агенттерден өзгеше болады деп күтілуде. Мысалы, дизопирамид және оризалин сияқты микротүтікше деполимерлеуші агенттердің жоғары концентрациясы эпидермальды жасушалардың анизотропты кеңеюін тудырады, ал KAND 11 тудырмайды. Сонымен қатар, KAND 11 мен дисопирамидті бірге қолдану дисопирамид тудыратын тамыр өсу реакциясын тудырды және KAND 11 тудыратын өсудің тежелуі байқалды (S4 сурет). Біз сондай-ақ аса сезімтал дисопирамид 1-1 (phs1-1) мутантының KAND 11-ге реакциясын талдадық. phs1-1 канондық емес тубулинкиназа нүктелік мутациясына ие және дизопирамидпен өңделген кезде қысқа тамырлар шығарады9,20. KAND 11 бар агар ортасында өсірілген phs1-1 мутантты көшеттерінің тамырлары дисопирамидте өсірілгендерге ұқсас қысқа болды (S5 сурет).
Сонымен қатар, біз KAND 11-мен өңделген көшеттердің тамыр меристемасында профаза аймақтары, ұршықшалар және фрагмопластар сияқты митоздық микротүтікше құрылымдарын байқадық. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS бақылауларына сәйкес, митоздық микротүтікшелер санының айтарлықтай азаюы байқалды (6c-сурет).
KAND 11 жасушаішілік ажыратымдылығындағы цитоуыттылығын сипаттау үшін біз темекі BY-2 суспензия жасушаларын KAND 11-мен өңдеп, олардың реакциясын бақыладық. KAND 11-дің кортикальды микротүтікшелерге әсерін бағалау үшін алдымен микротүтікшелерді флуоресцентті түрде белгілейтін TagRFP-TUA6 экспрессиялайтын BY-2 жасушаларына KAND 11 қостық. Кортикальды микротүтікшелердің тығыздығы цитоплазмалық пиксельдер арасындағы цитоскелеттік пиксельдердің пайызын сандық түрде анықтайтын кескін талдауын қолдану арқылы бағаланды. Талдау нәтижелері 50 мкМ немесе 100 мкМ KAND 11-мен 1 сағат бойы өңдегеннен кейін тығыздық сәйкесінше 0,94 ± 0,74% немесе 0,23 ± 0,28% дейін айтарлықтай төмендегенін, ал DMSO-мен өңделген жасушалардың тығыздығы 1,61 ± 0,34% құрағанын көрсетті (7a-сурет). Бұл нәтижелер Arabidopsis-тегі KAND 11 емі кортикальды микротүтікшелердің деполимерленуін тудыратыны туралы бақылаумен сәйкес келеді (6b-сурет). Біз сондай-ақ KAND 11-дің дәл осындай концентрациясымен өңдегеннен кейін GFP-ABD-белгіленген актин жіпшелері бар BY-2 желісін зерттедік және KAND 11 емі актин жіпшелерін бұзатынын байқадық. 50 мкМ немесе 100 мкМ KAND 11-мен 1 сағат бойы өңдеу актин жіпшелерінің тығыздығын сәйкесінше 1,20 ± 0,62% немесе 0,61 ± 0,26% дейін айтарлықтай төмендетті, ал DMSO-мен өңделген жасушалардағы тығыздық 1,69 ± 0,51% болды (2-сурет). 7b). Бұл нәтижелер актин жіпшелеріне әсер етпейтін пропизамидтің және микротүтікшелерге әсер етпейтін актин деполимеризаторы латрункулин B-нің әсерлерімен қарама-қайшы келеді (SI S6-сурет). Сонымен қатар, кумамонамид 1, кумамонамид қышқылы 6 немесе KAND 11-мен емдеу HeLa жасушаларындағы микротүтікшелерге әсер еткен жоқ (SI S7 суреті). Осылайша, KAND 11 әсер ету механизмі белгілі цитоскелет бұзушыларынан өзгеше деп есептеледі. Сонымен қатар, KAND 11-мен өңделген BY-2 жасушаларын микроскопиялық бақылауымыз KAND 11 емдеу кезінде жасуша өлімінің басталғанын анықтады және Эванс көк боялған өлі жасушаларының үлесі KAND 11 емдеуінің 30 минутынан кейін айтарлықтай өспегенін, ал 50 мкМ немесе 100 мкМ KAND-пен 90 минут емдеуден кейін өлі жасушалар саны сәйкесінше 43,7% немесе 80,1% дейін өскенін көрсетті (7c сурет). Жалпы алғанда, бұл деректер жаңа урсол қышқылының туындысы KAND 11 бұрын белгісіз әсер ету механизмі бар өсімдікке тән цитоскелет ингибиторы екенін көрсетеді.
KAND темекі BY-2 жасушаларының кортикальды микротүтікшелеріне, актин жіпшелеріне және тіршілік қабілетіне әсер етеді. (a) TagRFP-TUA6 қатысуымен BY-2 жасушаларындағы кортикальды микротүтікшелерді визуализациялау. KAND 11 (50 мкМ немесе 100 мкМ) немесе DMSO-мен өңделген BY-2 жасушалары конфокальды микроскопия арқылы зерттелді. Кортикальды микротүтікшелердің тығыздығы 25 тәуелсіз жасушаның микрографиясынан есептелді. Әріптер айтарлықтай айырмашылықтарды көрсетеді (Tukey HSD сынағы, б.< 0,05). Масштаб жолағы = 10 мкм. (b) GFP-ABD2 қатысуымен көрінетін BY-2 жасушаларындағы кортикальды актин жіпшелері. KAND 11 (50 мкМ немесе 100 мкМ) немесе DMSO-мен өңделген BY-2 жасушалары конфокальды микроскопия арқылы зерттелді. Кортикальды актин жіпшелерінің тығыздығы 25 тәуелсіз жасушаның микрографияларынан есептелді. Әріптер айтарлықтай айырмашылықтарды көрсетеді (Tukey HSD сынағы, б.< 0,05). Масштаб жолағы = 10 мкм. (c) Эванс көк бояуы арқылы өлі BY-2 жасушаларын бақылау. KAND 11 (50 мкМ немесе 100 мкМ) немесе DMSO-мен өңделген BY-2 жасушалары жарық өрісті микроскопия арқылы зерттелді. n=3. Масштаб жолағы = 100 мкм.
Жаңа табиғи өнімдердің ашылуы және қолданылуы медицина мен ауыл шаруашылығын қоса алғанда, адам өмірінің әртүрлі салаларында айтарлықтай жетістіктерге әкелді. Табиғи ресурстардан пайдалы қосылыстар алу үшін тарихи зерттеулер жүргізілді. Атап айтқанда, актиномицеттер нематодаларға қарсы паразитке қарсы антибиотиктер ретінде пайдалы екені белгілі, себебі олар ивермектиннің қорғасын қосылысы - авермектин және блеомицин және оның туындылары сияқты әртүрлі екінші реттік метаболиттерді өндіру қабілетіне байланысты қатерлі ісікке қарсы агент ретінде медициналық мақсатта қолданылады21,22. Сол сияқты, актиномицеттерден әртүрлі гербицидтік қосылыстар табылды, олардың кейбіреулері қазірдің өзінде коммерциялық мақсатта қолданылады1,23. Сондықтан, қажетті биологиялық белсенділігі бар табиғи өнімдерді бөліп алу үшін актиномицет метаболиттерін талдау тиімді стратегия болып саналады. Бұл зерттеуде біз S. werraensis-тен жаңа қосылыс, кумамонамидті таптық және оны сәтті синтездедік. Урсон қышқылы - урбенамид пен оның туындыларының синтетикалық аралық өнімі. Ол тамырдың бұйралануына, орташа немесе күшті гербицидтік белсенділікке және өсімдік микротүтікшелеріне тікелей немесе жанама түрде зиян келтіруі мүмкін. Дегенмен, урмотон қышқылының әсер ету механизмі қолданыстағы микротүтікше ингибиторларынан өзгеше болуы мүмкін, себебі KAND 11 актин жіпшелерін бұзады және жасуша өлімін тудырады, бұл урмотон қышқылы мен оның туындыларының цитоскелеттік құрылымдардың кең ауқымына әсер ететін реттеуші механизмді көрсетеді.
Урбенон қышқылының егжей-тегжейлі сипаттамасы урбенон қышқылының әсер ету механизмін жақсырақ түсінуге көмектеседі. Атап айтқанда, келесі мақсат - урсон қышқылының тотықсызданған микротүтікшелерге байланысу қабілетін бағалау, урсон қышқылы мен оның туындылары микротүтікшелерге тікелей әсер ететінін және оларды деполимерлейтінін немесе олардың әрекеті микротүтікшелердің тұрақсыздануына әкелетінін анықтау. Сонымен қатар, микротүтікшелер тікелей нысана болмаған жағдайда, урсон қышқылының өсімдік жасушаларындағы әсер ету орнын және молекулалық нысаналарын анықтау байланысты қосылыстардың қасиеттерін және гербицидтік белсенділікті жақсартудың мүмкін жолдарын одан әрі түсінуге көмектеседі. Біздің биоактивтілік талдауымыз урсон қышқылының Arabidopsis thaliana, темекі және бауырқұрт сияқты өсімдіктердің өсуіне бірегей цитотоксикалық қабілетін анықтады, ал E. coli де, HeLa жасушалары да әсер етпеді. Жануар жасушаларына уыттылығы аз немесе мүлдем жоқ, егер олар ашық ауыл шаруашылығы алқаптарында пайдалану үшін гербицид ретінде жасалса, олардың артықшылығы болып табылады. Шынында да, микротүтікшелер эукариоттарда кең таралған құрылымдар болғандықтан, өсімдіктердегі олардың селективті тежелуі гербицидтерге қойылатын негізгі талап болып табылады. Мысалы, тубулинмен тікелей байланысатын және полимерленуді тежейтін микротүтікшелерді деполимерлейтін пропизамид жануарлар жасушаларына уыттылығы төмен болғандықтан гербицид ретінде қолданылады24. Дизопирамидтен айырмашылығы, байланысты бензамидтердің нысана ерекшеліктері әртүрлі. Өсімдік микротүтікшелерінен басқа, RH-4032 немесе бензоксамид сонымен қатар жануарлар жасушаларының немесе оомицеттердің микротүтікшелерін тежейді, ал залиламид фитоуыттылығы төмен болғандықтан фунгицид ретінде қолданылады25,26,27. Жаңадан ашылған аю және оның туындылары өсімдіктерге селективті цитотоксикалық әсер етеді, бірақ одан әрі модификациялау олардың нысана ерекшелігін өзгертуі мүмкін екенін, бұл патогенді саңырауқұлақтарды немесе оомицеттерді бақылау үшін қосымша туындыларды қамтамасыз етуі мүмкін екенін атап өткен жөн.
Урбенон қышқылының және оның туындыларының бірегей қасиеттері оларды гербицидтер ретінде дамыту және зерттеу құралдары ретінде пайдалану үшін пайдалы. Өсімдік жасушаларының пішінін бақылаудағы цитоскелеттің маңыздылығы кеңінен танылған. Бұрынғы зерттеулер өсімдіктердің морфогенезді дұрыс бақылау үшін микротүтікше динамикасын басқару арқылы кортикальды микротүтікшелердің ұйымдастырылуының күрделі механизмдерін дамытқанын көрсетті. Микротүтікшелердің белсенділігін реттеуге жауапты көптеген молекулалар анықталды және онымен байланысты зерттеулер әлі де жалғасуда3,4,28. Өсімдік жасушаларындағы микротүтікшелердің динамикасы туралы қазіргі түсінігіміз кортикальды микротүтікшелердің ұйымдастырылу механизмдерін толық түсіндірмейді. Мысалы, дизопирамид те, оризалин де микротүтікшелерді деполимерлендіре алса да, дизопирамид түбірдің қатты деформациясын тудырады, ал оризалин салыстырмалы түрде жеңіл әсер етеді. Сонымен қатар, микротүтікшелерді тұрақтандыратын тубулиндегі мутациялар тамырларда декстроротацияны тудырады, ал микротүтікшелердің динамикасын тұрақтандыратын паклитаксел ондай әсер етпейді. Сондықтан, урсол қышқылының молекулалық нысаналарын зерттеу және анықтау өсімдік кортикальды микротүтікшелерінің реттелуіне жаңа түсініктер беруі керек. Сол сияқты, болашақта дисопирамид сияқты бұрмаланған өсуді ынталандыруда тиімді химиялық заттарды және оризалин немесе кумамотор қышқылы сияқты тиімділігі төмен химиялық заттарды салыстыру бұрмаланған өсудің қалай жүретіні туралы түсінік береді.
Екінші жағынан, қорғанысқа байланысты цитоскелеттік қайта құрылымдар урсон қышқылының цитоуыттылығын түсіндірудің тағы бір мүмкіндігі болып табылады. Патогеннің инфекциясы немесе өсімдік жасушаларына эликтордың енгізілуі кейде цитоскелеттің бұзылуына және кейіннен жасуша өліміне әкеледі29. Мысалы, оомицеттерден алынған криптоксантиннің темекі жасушаларының өліміне дейін микротүтікшелер мен актин жіпшелерін бұзатыны туралы хабарланған, бұл KAND емімен болатын жағдайға ұқсас30,31. Урсон қышқылымен индукцияланған қорғаныс реакциялары мен жасушалық реакциялар арасындағы ұқсастықтар бізді олардың жалпы жасушалық процестерді тудыратыны туралы болжам жасауға мәжбүр етті, дегенмен урсон қышқылының криптоксантинге қарағанда жылдамырақ және күштірек әсері айқын. Дегенмен, зерттеулер актин жіпшелерінің бұзылуы жасушалардың өздігінен өліміне ықпал ететінін көрсетті, бұл әрқашан микротүтікшелердің бұзылуымен бірге жүрмейді29. Сонымен қатар, урсон қышқылының туындылары сияқты патогеннің немесе эликтордың тамырдың бұрмаланған өсуіне әкелетіні әлі белгісіз. Осылайша, қорғаныс реакциялары мен цитоскелет арасындағы молекулалық білім шешілуі керек тартымды мәселе болып табылады. Урсон қышқылына байланысты төмен молекулалық салмақты қосылыстардың, сондай-ақ әртүрлі потенциалды туындылардың болуын пайдалану арқылы олар белгісіз жасушалық механизмдерді нысанаға алу мүмкіндіктерін ұсынуы мүмкін.
Микротүтікшелердің динамикасын модуляциялайтын жаңа қосылыстардың ашылуы және қолданылуы өсімдік жасушаларының пішінін анықтаудың негізінде жатқан күрделі молекулалық механизмдерді шешудің қуатты әдістерін қамтамасыз етеді. Осыған байланысты, микротүтікшелер мен актин жіпшелеріне әсер ететін және жасуша өлімін тудыратын жақында жасалған урмотон қышқылы қосылысы микротүтікшелерді бақылау мен осы басқа механизмдер арасындағы байланысты шешуге мүмкіндік береді. Осылайша, урбенон қышқылын қолданатын химиялық және биологиялық талдау өсімдік цитоскелетінің молекулалық реттеу механизмдерін түсінуге көмектеседі.
S. werraensis MK493-CF1 препаратын 2% (w/v) галактоза, 2% (w/v) эссенция пастасынан, 1% (w/v) Bacto құрамынан тұратын 110 мл тұқымдық ортасы бар 500 мл шатастырылған Эрленмейер колбасына егіңіз. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) жүгері сығындысынан (KOGOSTCH Co., Ltd., Жапония), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 және 0,2% CaCO3 деиондалған суда (стерилизация алдында рН 7,4). Тұқым дақылдары айналмалы шайқағышта (180 айн/мин) 27°C температурада 2 күн бойы инкубацияланды. Қатты күйдегі ашыту арқылы өндірістік өсіру. Тұқым дақылы (7 мл) 15 г престелген арпадан (MUSO Co., Ltd., Жапония) және 25 г деионизацияланған судан (стерилизация алдында рН реттелмеген) тұратын 40 г өндірістік ортасы бар 500 мл К-1 колбасына ауыстырылды. Ашыту қараңғы жерде 30°C температурада 14 күн бойы жүргізілді. Ашыту материалы 40 мл/бөтелке EtOH-пен экстракцияланып, центрифугаланды (1500 г, 4°C, 10 мин). Дақылдың үстіңгі қабаты (60 мл) 10% MeOH/EtOAc қоспасымен экстракцияланды. Органикалық қабат төмендетілген қысыммен буланып, қалдық (59,5 мг) алынды, ол кері фазалы бағанда (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 мкм, ID 10 мм × ұзындығы 250 мм) градиенттік элюциямен (0–10 минут: 90%) HPLC-ге ұшырады, H2O/CH3CN, 10–35 минут: 90% H2O/CH3CN-ден 70% H2O/CH3CN-ге дейін (градиент), 35–45 минут: 90% H2O/EtOH, 45–155 минут: 90% H2O/EtOH-тан 100% EtOH-қа дейін (градиент (градиент), 155–200 мин: 100% EtOH) 1,5 мл/мин ағын жылдамдығында, кумамонамид (1,36,0 мг) ақ аморфты ұнтақ ретінде бөлініп алынды.
Кумамотоамид(1); 1H-ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Гц, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Гц 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Гц, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-ЯМР (125 МГц, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ есептелген мәні: 141.0659, өлшенген мәні: 141.0663, IR νмакс 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 см–1.
Колумбия тұқымдары (Col-0) зерттеуге рұқсатпен Arabidopsis биологиялық ресурстық орталығынан (ABRC) алынды. Col-0 тұқымдары біздің зертханалық жағдайымызда көбейтіліп, күтіліп, жабайы типтегі Arabidopsis өсімдіктері ретінде пайдаланылды. Arabidopsis тұқымдары беткі стерилизацияланып, 2% сахароза (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-морфолино)этансульфон қышқылы (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) және 1,5% агар (Fujifilm Wako Pure Chemical) бар жартылай берік Murashige және Skoog ортасында, рН 5,7, 23 °C температурада және тұрақты жарықта өсірілді. phs1-1 мутантының тұқымдарын Т. Хашимото (Нара ғылым және технология институты) ұсынды.
SR-1 штаммының тұқымдары Т. Хашимото (Нара ғылым және технология институты) ұсынды және жабайы типтегі темекі өсімдіктері ретінде пайдаланылды. Темекі тұқымдары беткі қабатынан зарарсыздандырылып, өнуді ынталандыру үшін үш түн бойы зарарсыздандырылған суда жібітілді, содан кейін рН 5,7 болатын 2% сахароза, 0,05% (w/v) MES және 0,8% геллан шайыры (Fujifilm Wako Pure Chemical) Мурашиге және Skoog ортасы) бар жартылай күшті ерітіндіге салынып, тұрақты жарықта 23°C температурада инкубацияланды.
Tak-1 штаммын Т. Кохчи (Киото университеті) ұсынды және бауырды зерттеу үшін стандартты тәжірибелік бірлік ретінде пайдаланылды. Гемма стерильденген өсірілген өсімдіктерден алынды, содан кейін 1% сахароза және 0,3% геллан шайыры бар Gamborg B5 ортасына (Fujifilm Wako Pure Chemical) жағылды және үздіксіз жарық астында 23°C температурада инкубацияланды.
Темекі BY-2 жасушаларын (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) С. Хасезава (Токио университеті) ұсынды. BY-2 жасушалары модификацияланған Линсмейер және Скуг ортасында 95 есе сұйылтылып, апта сайын 2,4-дихлорфеноксисірке қышқылымен толықтырылды 32. Жасуша суспензиясы айналмалы шайқағышта 130 айн/мин жылдамдықпен қараңғыда 27°C температурада араластырылды. Жасушаларды жаңа ортаның көлемінен 10 есе көп көлемде жуып, сол ортада қайта суспензиялаңыз. Түсті қырыққабат мозаикалық вирусының 35S промоторының астында TagRFP-TUA6 микротүтікше маркерін немесе GFP-ABD2 актин жіпше маркерін тұрақты түрде экспрессиялайтын BY-2 трансгенді жасуша желілері сипатталғандай жасалды33,34,35. Бұл жасуша желілерін бастапқы BY-2 жасуша желісі үшін қолданылатын процедураларға ұқсас процедураларды қолдана отырып, қолдауға және синхрондауға болады.
HeLa жасушалары 37°C инкубаторда 5% CO2 қосылған 10% ұрық сиырының сарысуымен, 1,2 U/мл пенициллинмен және 1,2 мкг/мл стрептомицинмен толықтырылған Дульбекконың модификацияланған Eagle's ортасында (DMEM) (Life Technologies) өсірілді.
Осы қолжазбада сипатталған барлық эксперименттер Жапонияның биоқауіпсіздік ережелері мен нұсқауларына сәйкес жүргізілді.
Қосылыстар диметилсульфоксидте (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) негізгі ерітінділер ретінде ерітіліп, Arabidopsis және темекі үшін MS ортасында немесе бауыр сусыны үшін Gamborg B5 ортасында сұйылтылды. Тамырдың өсуін тежеу талдауы үшін әр пластинаға 10-нан астам тұқым көрсетілген қосылыстар немесе DMSO бар агар ортасына себілді. Тұқымдар өсу камерасында 7 күн бойы инкубацияланды. Көшеттер суретке түсіріліп, тамырлардың ұзындығы өлшенді. Arabidopsis өнуін талдау үшін әр пластинаға 48 тұқым 200 мкМ қосылыс немесе DMSO бар агар ортасына себілді. Arabidopsis тұқымдары өсу камерасында өсірілді және өнген көшеттердің саны өнгеннен кейін 7 күннен кейін есептелді (dag). Темекінің өнуін талдау үшін әр пластинаға 24 тұқым 200 мкМ KAND немесе DMSO бар агар ортасына себілді. Темекі тұқымдары өсу камерасында өсірілді және өнген көшеттердің саны 14 күннен кейін есептелді. Бауыр шырынының өсуін тежеу талдауы үшін әр пластинадан 9 эмбрион көрсетілген KAND немесе DMSO концентрациялары бар агар ортасына салынып, өсу камерасында 14 күн бойы инкубацияланды.
Тамыр меристемасының ұйымдастырылуын визуализациялау үшін 5 мг/мл пропидий йодидімен (PI) боялған көшеттерді пайдаланыңыз. PI сигналдары TCS SPE конфокальды лазерлік сканерлеу микроскопын (Leica Microsystems) пайдаланып флуоресценттік микроскопия арқылы байқалды.
Тамырларды β-глюкуронидазамен (GUS) гистохимиялық бояу Malami мен Benfey36 сипаттаған хаттамаға сәйкес жүргізілді. Көшеттер түні бойы 90% ацетонға бекітіліп, GUS буферінде 0,5 мг/мл 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-d-глюкурон қышқылымен 1 сағат бойы боялып, гидратталған хлоральдегид ерітіндісіне (8 г хлоральгидрат, 2 мл су және 1 мл глицерин) салынып, Axio Imager M1 микроскопын (Carl Zeiss) пайдаланып дифференциалды интерференциялық контрастты микроскопия арқылы бақыланды.
Тамыр бұрыштары тігінен орналастырылған тақтайшаларда өсірілген 7 күндік көшеттерде өлшенді. 6-қадамда сипатталғандай, тамыр бұрышын гравитация векторының бағыты бойынша өлшеңіз.
Кортикальды микротүтікшелердің орналасуы сипатталғандай байқалды, хаттамаға шамалы өзгерістер енгізілді 37. Анти-β-тубулин антиденесі (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) және Alexa Fluor 488-конъюгацияланған тышқанға қарсы IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) сәйкесінше 1:1000 және 1:100 сұйылту кезінде бастапқы және қосымша антиденелер ретінде пайдаланылды. Флуоресценциялық кескіндер TCS SPE конфокальды лазерлік сканерлеу микроскопын (Leica Microsystems) пайдаланып алынды. Z-стек кескіндерін алыңыз және өндірушінің нұсқауларына сәйкес максималды қарқындылық проекцияларын жасаңыз.
HeLa жасушаларының көбеюін талдау өндірушінің нұсқауларына сәйкес Cell Counting Kit 8 (Dojindo) көмегімен жүргізілді.
E. coli DH5α өсуі 600 нм (OD600) спектрофотометрін пайдаланып, дақылдағы жасуша тығыздығын өлшеу арқылы талданды.
Трансгенді BY-2 жасушаларындағы цитоқаңқа құрылымы CSU-X1 конфокальды сканерлеу құрылғысымен (Yokogawa) және sCMOS камерасымен (Zyla, Andor Technology) жабдықталған флуоресцентті микроскоп арқылы бақыланды. Цитосқаңқа тығыздығы кескін талдауы арқылы бағаланды, ол сипатталғандай ImageJ бағдарламалық жасақтамасын пайдаланып конфокальды кескіндердегі цитоплазмалық пиксельдер арасындағы цитоскелеттік пиксельдердің пайызын сандық түрде анықтады38,39.
BY-2 жасушаларындағы жасуша өлімін анықтау үшін жасуша суспензиясының аликвотасы бөлме температурасында 10 минут бойы 0,05% Эванс көк бояуымен инкубацияланды. Өлі жасушалардың Эванс көк бояуымен селективті бояуы тірі жасушалардан тұтас плазмалық мембрана арқылы бояғыштың экструзиясына байланысты40. Боялған жасушалар жарық өрісті микроскоп (BX53, Olympus) көмегімен бақыланды.
HeLa жасушалары 10% FBS қосылған DMEM ерітіндісінде 37°C және 5% CO2 температурада ылғалдандырылған инкубаторда өсірілді. Жасушалар 37°C температурада 6 сағат бойы 100 мкМ KAND 11, кумамонам қышқылы 6, кумамонамид 1, 100 нг/мл колцемид (Gibco) немесе 100 нг/мл Nocodmaze (Sigma) ерітіндісімен өңделді. Жасушалар бөлме температурасында 10 минут бойы MetOH-пен, содан кейін 5 минут бойы ацетатпен бекітілді. Бекітілген жасушалар 0,5% BSA/PBS-те сұйылтылған β-тубулин бастапқы антиденесімен (1D4A4, Proteintech: 66240-1) 2 сағат бойы инкубацияланды, TBST-пен 3 рет жуылды, содан кейін Alexa Fluor ешкі антиденесімен инкубацияланды. 488 1 сағат. – Тышқан IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) және 0,5% BSA/PBS ерітіндісінде сұйылтылған 15 нг/мл 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI). TBST-пен үш рет жуғаннан кейін боялған жасушалар Nikon Eclipse Ti-E инверттелген микроскопында байқалды. Суреттер MetaMorph бағдарламалық жасақтамасын (Molecular Devices) пайдаланып, салқындатылған Hamamatsu ORCA-R2 CCD камерасымен түсірілді.
Жарияланған уақыты: 2024 жылғы 17 маусым