Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет.Сіз пайдаланып жатқан шолғыш нұсқасында шектеулі CSS қолдауы бар.Жақсы нәтижеге қол жеткізу үшін шолғыштың жаңарақ нұсқасын пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз).Әзірше, тұрақты қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты сәндеусіз немесе JavaScriptсіз көрсетеміз.
Табиғи өнімдерді табу және тиімді пайдалану адам өмірін жақсартуға көмектеседі.Өсімдіктердің өсуін тежейтін химиялық заттар арамшөптермен күресу үшін гербицидтер ретінде кеңінен қолданылады.Гербицидтердің әртүрлі түрлерін қолдану қажеттілігіне байланысты жаңа әсер ету механизмдері бар қосылыстарды анықтау қажеттілігі туындады.Бұл зерттеуде біз Streptomyces werraensis MK493-CF1 жаңа N-алкоксипиррол қосылысын, куманамидті аштық және толық синтез процесін орнаттық.Биологиялық белсенділікті талдау арқылы біз урс-моноамин қышқылы урс-моноамидтің синтетикалық аралық өнімі және потенциалдыөсімдіктердің өсу ингибиторы.Сонымен қатар, біз HeLa жасушаларының өсуіне теріс әсер етпестен жоғары гербицидтік белсенділігі бар урбенилокси туындысын (UDA) қоса алғанда, әртүрлі урбен қышқылының туындыларын әзірледік.Біз сондай-ақ урмотоник қышқылының туындылары өсімдік микротүтіктерін бұзатынын анықтадық;сонымен қатар, КАНД актин жіптеріне әсер етеді және жасуша өлімін тудырады;Бұл көп қырлы әсерлер белгілі микротүтік тежегіштерінен ерекшеленеді және жаңа гербицидтерді жасауда маңызды артықшылықты білдіретін урсон қышқылына әсер етудің жаңа механизмін ұсынады.
Пайдалы табиғи өнімдер мен олардың туындыларын табу және тәжірибеде қолдану адам өмірінің сапасын жақсарту құралы болып табылады.Микроорганизмдер, өсімдіктер мен жәндіктер өндіретін екіншілік метаболиттер медицина мен ауыл шаруашылығында үлкен жетістіктерге әкелді.Табиғи өнімдерден көптеген антибиотиктер мен лейкозға қарсы препараттар жасалды.Сонымен қатар, әртүрлі түрлеріпестицидтер, ауыл шаруашылығында пайдалану үшін осы табиғи өнімдерден фунгицидтер мен гербицидтер алынады.Атап айтқанда, арамшөптерге қарсы гербицидтер қазіргі ауыл шаруашылығында дақылдардың өнімділігін арттырудың маңызды құралы болып табылады және қосылыстардың әртүрлі түрлері қазірдің өзінде коммерциялық мақсатта қолданылады.Өсімдіктердегі фотосинтез, аминқышқылдарының алмасуы, жасуша қабырғасының синтезі, митоздың реттелуі, фитогормон сигналы немесе ақуыз синтезі сияқты бірнеше жасушалық процестер гербицидтердің типтік нысанасы болып саналады.Микротүтіктердің қызметін тежейтін қосылыстар митоздық реттеуге әсер ету арқылы өсімдіктердің өсуіне әсер ететін гербицидтердің кең таралған класы болып табылады2.
Микротүтікшелер цитоскелеттің құрамдас бөлігі болып табылады және эукариоттық жасушаларда кеңінен сақталады.Тубулин гетеродимері α-тубулиннен және β-тубулиннен түзілетін сызықтық микротүтікше протофиламенттерінен тұрады, цилиндрлік құрылымды құрайтын 13 протофиламент бар.Микротүтікшелер өсімдік жасушаларында жасуша пішінін, жасушаның бөлінуін және жасуша ішілік тасымалдауды анықтауды қоса алғанда, көптеген рөлдерді атқарады3,4.Өсімдік жасушаларында интерфазалық плазмалық мембрананың астында микротүтікшелер бар және бұл кортикальды микротүтікшелер целлюлоза синтаза комплекстерін реттеу арқылы целлюлоза микрофибрилдерінің ұйымдастырылуын басқарады деп есептеледі4,5.Түбір ұшының жылдам созылу аймағында болатын тамыр эпидермисінің жасушаларының қыртыстық микротүтікшелері латеральды орналасады, ал целлюлоза микроталшықтары осы микротүтікшелердің артынан жүреді және жасушаның кеңею бағытын шектейді, осылайша жасушаның анизотропты ұзаруына ықпал етеді.Сондықтан микротүтіктердің қызметі өсімдік морфологиясымен тығыз байланысты.Тубулинді кодтайтын гендердегі аминқышқылдарының алмастырылуы кортикальды микротүтікше массивтерінің қисаюын және Arabidopsis 6,7-де сол немесе оң жақты өсуді тудырады.Сол сияқты, микротүтікше динамикасын реттейтін микротүтікшелермен байланысты белоктардағы мутациялар да тамырдың бұрмаланған өсуіне әкелуі мүмкін8,9,10,11,12,13.Сонымен қатар, претилахлор деп аталатын дизопирамид сияқты микротүтіктерді бұзатын гербицидтермен емдеу де сол жақты қиғаш тамырдың өсуін тудырады14.Бұл деректер микротүтіктер функциясын дәл реттеу өсімдіктің өсу бағытын анықтау үшін өте маңызды екенін көрсетеді.
Микротүтікше ингибиторларының әртүрлі түрлері ашылды және бұл препараттар цитоскелеттік зерттеулерге, сонымен қатар ауыл шаруашылығы мен медицинаға айтарлықтай үлес қосты2.Атап айтқанда, оризалин, динитроанилин қосылыстары, дизопирамид, бензамидпен байланысты қосылыстар және олардың аналогтары микротүтіктердің қызметін тежей алады және сол арқылы өсімдіктердің өсуін тежейді.Сондықтан олар гербицид ретінде кеңінен қолданылады.Дегенмен, микротүтікшелер өсімдік және жануарлар жасушаларының маңызды құрамдас бөлігі болғандықтан, микротүтікше ингибиторларының көпшілігі екі жасуша түріне де цитотоксикалық болып табылады.Сондықтан, гербицидтер ретінде танылған пайдалылығына қарамастан, практикалық мақсатта микротүтікке қарсы агенттердің шектеулі саны қолданылады.
Streptomyces - аэробты, грам-позитивті, жіп тәрізді бактерияларды қамтитын және қайталама метаболиттердің кең спектрін өндіру қабілетімен кеңінен танымал Streptomyces тұқымдасы.Сондықтан ол жаңа биологиялық белсенді табиғи өнімдердің маңызды көздерінің бірі болып саналады.Ағымдағы зерттеуде біз Streptomyces werraensis MK493-CF1 және S. werraensis ISP 5486-дан бөлініп алынған кумамонамид деп аталатын жаңа қосылысты аштық. Спектрлік талдау мен толық спектрлік талдауды пайдалана отырып, кумамонамидтің құрылымы және оның бірегей N-алкоксипиррол қаңқасы сипатталды. анықталды.синтез.Урсмоноамид пен оның туындыларының синтетикалық аралық өнімі болып табылатын урсмон қышқылы танымал арабидопсис thaliana өсімдігінің өсуі мен өнуін тежейтіні анықталды.Құрылым-белсенділік қатынасын зерттеуде урсон қышқылының (KAND) нонилокси туындысы деп аталатын урсон қышқылына өзгертілген C9 қосылысының өсу мен өнуге ингибиторлық әсерін айтарлықтай күшейтетінін анықтадық.Атап айтқанда, жаңадан табылған өсімдік өсу ингибиторы темекі мен бауырдың өсуіне де әсер етті және бактериялар немесе HeLa жасушалары үшін цитотоксикалық емес.Сонымен қатар, кейбір урмотоник қышқылының туындылары бұрмаланған тамыр фенотипін тудырады, бұл бұл туындылар микротүтіктерге тікелей немесе жанама әсер етеді.Осы идеяға сәйкес, иммуногистохимиялық немесе флуоресцентті ақуыздармен таңбаланған микротүтіктерді бақылауларымыз KAND өңдеу микротүтіктерді деполимеризациялауды көрсетеді.Сонымен қатар, кумамотоник қышқылының туындыларымен емдеу актин микрофиламенттерін бұзды.Осылайша, біз бірегей әсер ету механизмі цитоскелеттің бұзылуын қамтитын жаңа өсімдік өсу ингибиторын таптық.
MK493-CF1 штаммы Токиодағы Шинагава-куда топырақтан бөлініп алынды.MK493-CF1 штаммы жақсы тармақталған стромальды мицелий түзді.16S рибосомалық РНҚ генінің ішінара тізбегі (1422 bp) анықталды.Бұл штамм S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: типтік штамм, 99,93%) өте ұқсас.Осы нәтижеге сүйене отырып, бұл штамм S. werraensis типті штаммымен тығыз байланысты екені анықталды.Сондықтан біз бұл штаммды S. werraensis MK493-CF1 деп уақытша атадық.S. werraensis ISP 5486T да бірдей биоактивті қосылыстар шығарады.Бұл микроорганизмнен табиғи өнімдерді алу бойынша ерте зерттеулер аз болғандықтан, одан әрі химиялық зерттеулер жүргізілді.S. werraensis MK493-CF1 арпа қоректік ортада қатты күйдегі ашыту арқылы 30°C температурада 14 күн бойы өсіргеннен кейін орта 50% EtOH-мен экстракцияланды.59,5 мг шикі сығынды алу үшін 60 мл үлгі кептірілді.Шикі сығынды N-метокси-1Н-пиррол-2-карбоксамидті (1, куманамид деп аталды, 36,0 мг) алу үшін кері фазалық HPLC жүргізілді.1 жалпы мөлшері шикі сығындының шамамен 60% құрайды.Сондықтан біз кумамотоамид 1 қасиеттерін егжей-тегжейлі зерттеуді шештік.
Кумамонамид 1 ақ аморфты ұнтақ және жоғары ажыратымдылықтағы масс-спектрометрия (HRESIMS) C6H8N2O2 растайды (1-сурет).Бұл қосылыстың C2 алмастырылған пиррол фрагменті δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Гц, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH 1H ЯМР спектрінде: 4,5 Гц) сипатталады. , H-5) және δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Гц, H-6) және 13C ЯМР спектрі төрт sp2 көміртегі атомының болуын көрсетеді.С2 позициясында амид тобының болуы δC 161.1 кезінде С-3 протонынан амидтік карбонилді көміртегіге дейінгі HMBC корреляциясымен бағаланды.Сонымен қатар, δH 4.10 (3H, S) және δC 68.3 нүктелерінде 1 H және 13 C ЯМР шыңдары молекулада N-метокси топтарының бар екенін көрсетеді.Метокси тобының дұрыс орны спектроскопиялық талдау арқылы әлі анықталмағанымен, мысалы, күшейтілген айырмашылық спектроскопиясы және ядролық Overhauser аббревиатурасы (NOEDF), N-метокси-1Н-пиррол-2-карбоксамид бірінші үміткер қосылыс болды.
1-нің дұрыс құрылымын анықтау үшін жалпы синтез жүргізілді (2а-сурет).Коммерциялық қол жетімді 2-аминопиридин 2-ні m-CPBA-мен өңдеу сандық кірісте сәйкес N-оксиді 3-ке әкелді.2-нің 2-аминоазидтенуінен кейін Абрамович сипаттаған циклоконденсация реакциясы бензолда 90°С температурада жүргізіліп, граммен қажетті 1-гидрокси-1Н-пиррол-2-карбонитрил 5 алынды.Жылдамдық 60% (екі кезең).15,16.4-тің метилденуі және гидролизі 1-метокси-1Н-пиррол-2-карбон қышқылын («кумотоник қышқылы» деп аталады) берді (6) жақсы кірістілікпен (70%, екі қадам).Ақырында, сулы аммиак арқылы 6-қышқылды хлорид аралық өнімі арқылы амидация Кумамото амидіне 98% шығымдылықпен 1 берді.Синтезделген 1-нің барлық спектрлік деректері оқшауланған 1-ге ұқсас болды, сондықтан 1-нің құрылымы анықталды;
Урбенамид пен урбен қышқылының жалпы синтезі және биологиялық белсенділігін талдау.(а) Кумамото амидінің жалпы синтезі.(b) Жеті күндік жабайы түрдегі Arabidopsis Columbia (Col) көшеттері көрсетілген концентрацияларда кумамонамид 6 немесе кумамонамид 1 бар Murashige және Skoog (MS) тақталарында өсірілді.Масштаб жолағы = 1 см.
Біріншіден, урбенамид пен оның аралық өнімдерінің биологиялық белсенділігін олардың өсімдіктердің өсуін модуляциялау қабілетіне бағаладық.Біз MS агар ортасына және осы қоректік ортаға өсірілген Arabidopsis thaliana өскініне урсмонамид 1 немесе урсмон қышқылының 6 түрлі концентрацияларын қостық.Бұл талдаулар 6 жоғары концентрациясы (500 мкм) тамырдың өсуін тежейтінін көрсетті (2б-сурет).Әрі қарай, біз 6-ның N1 позициясын ауыстыру арқылы әртүрлі туынды құралдарды генерацияладық және олар бойынша құрылым-әрекет қатынасын зерттеуді орындадық (аналогты синтез процесі Қолдау ақпаратында (SI) сипатталған).Арабидопсис өскіндері 50 мкм урсон қышқылының туындылары бар қоректік ортада өсірілді, тамыр ұзындығы өлшенді.суретте көрсетілгендей.3a, b және S1 суреттерінде көрсетілгендей, кумамо қышқылдары N1 позициясында әртүрлі ұзындықтағы сызықты сілтілі тізбектерге (9, 10, 11, 12 және 13) немесе үлкен сілтілі тізбектерге (15, 16 және 17) ие.Туындылар тамырдың өсуін айтарлықтай тежеуді көрсетті.Сонымен қатар, біз 200 мкМ 10, 11 немесе 17 қолдану өнуді тежейтінін анықтадық (3c және S2-суреттер).
Кумамото амидінің және онымен байланысты қосылыстардың құрылымдық-белсенділік байланысын зерттеу.(а) Аналогтардың құрылымы мен синтезінің схемасы.(b) 50 мкм кумамонамид туындылары бар немесе онсыз MS қоректік ортада өсірілген 7 күндік көшеттердің тамыр ұзындығының сандық көрсеткіштері.Жұлдызшалар жалған өңдеуден айтарлықтай айырмашылықтарды көрсетеді (t сынағы, б< 0,05).n>18. Деректер орташа ± SD ретінде көрсетілген.nt «сыналмаған» дегенді білдіреді, себебі тұқымдардың 50%-дан астамы өнбеген.(c) 200 мкм кумамонамидпен және тиісті қосылыстарсыз MS ортада 7 күн бойы инкубацияланған өңделген тұқымдардың өну жылдамдығының сандық көрсеткіштері.Жұлдызшалар жалған өңдеуден айтарлықтай айырмашылықтарды көрсетеді (хи-квадрат сынағы).n=96.
Бір қызығы, C9-дан ұзағырақ алкил бүйірлік тізбектерін қосу ингибиторлық белсенділікті төмендетті, бұл кумамот қышқылымен байланысты қосылыстар өздерінің биологиялық белсенділігін көрсету үшін белгілі бір өлшемдегі бүйірлік тізбектерді қажет етеді.
Құрылым-белсенділік қатынасын талдау C9 урсон қышқылына өзгертілгенін және урсон қышқылының нонилокси туындысы (бұдан әрі KAND 11 деп аталады) өсімдіктердің өсуінің ең тиімді ингибиторы болғанын көрсеткендіктен, біз KAND 11-нің егжей-тегжейлі сипаттамасын жүргіздік. Арабидопсисті емдеу 50 мкм KAND 11 өнуге толық дерлік кедергі келтірді, ал төмен концентрациялары (40, 30, 20 немесе 10 мкм) KAND 11 дозаға байланысты тамырдың өсуін тежеді (4а, б-сурет).KAND 11 тамыр меристемасының өміршеңдігіне әсер ететінін тексеру үшін біз пропидий йодидімен (PI) боялған тамыр меристемаларын зерттедік және меристема аумағының өлшемін өлшедік.Құрамында 25 мкм КАНД-11 бар қоректік ортада өсірілген өскіндер меристемасының өлшемі 151,1 ± 32,5 мкм болса, DMSO бар бақылау қоректік ортада өсірілген өскін меристемасының өлшемі 264,7 ± 30,8 мкм болды (4c, d-сурет) , бұл KAND-11 жасушалық белсенділікті қалпына келтіретінін көрсетеді.тарату.Тамыр меристемасы.Осыған сәйкес, KAND 11 өңдеуі түбір меристемасындағы CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS сигналының жасушаның бөліну маркерінің мөлшерін азайтты (4e-сурет) 17 .Бұл нәтижелер KAND 11 жасуша пролиферациясының белсенділігін төмендету арқылы тамырдың өсуін тежейтінін көрсетеді.
Урбен қышқылы туындыларының (урбенилокси туындыларының) өсуге тежеу әсерін талдау.(a) KAND 11 көрсетілген концентрациясы бар MS пластиналарында өсірілген 7 күндік жабайы түрдегі Col көшеттері. Масштаб жолағы = 1 см.(b) Тамыр ұзындығының сандық көрсеткіші.Әріптер елеулі айырмашылықтарды көрсетеді (Tukey HSD сынағы, б< 0,05).n>16. Деректер орташа ± SD ретінде көрсетіледі.(c) MS пластиналарында 25 мкм KAND бар немесе онсыз өсірілген пропидий йодидімен боялған жабайы типті Col тамырларының конфокальды микроскопиясы 11. Ақ жақшалар тамыр меристемасын көрсетеді.Масштаб жолағы = 100 мкм.(d) Тамыр меристемасының мөлшерін анықтау (n = 10-11).Статистикалық айырмашылықтар t-тестінің көмегімен анықталды (б< 0,05).Жолақтар меристеманың орташа өлшемін білдіреді.(e) CDKB2 құрылымы бар түбір меристемасының дифференциалды интерференциялық контрастты (DIC) микроскопиясы;1про: CDKB2;25 мкМ KAND талдауы бар немесе онсыз MS пластиналарында өсірілген 5 күндік көшеттерде 1-GUS боялған және боялған.
KAND 11 фитоуыттылығы басқа қосжарнақты өсімдік, темекі (Nicotiana tabacum) және негізгі құрлықтағы өсімдік үлгісіндегі организм, бауырсорғыш (Marchantia polymorpha) арқылы қосымша тексерілді.Arabidopsis жағдайындағыдай, құрамында 25 мкм KAND 11 бар қоректік ортада өсірілген темекі SR-1 өскіндері қысқа тамырлар берді (5а-сурет).Сонымен қатар, 48 тұқымның 40-ы құрамында 200 мкм KAND 11 бар тақтайшаларда өніп шықты, ал барлық 48 тұқым жалған өңделген орталарда өніп шықты, бұл KAND жоғары концентрацияларының маңызды екенін көрсетеді (p.< 0,05;хи сынағы -квадрат) темекінің өнуін тежеді.(Cурет 5b).Сонымен қатар, бауыр құртындағы бактериялардың өсуін тежейтін KAND 11 концентрациясы Арабидопсистегі тиімді концентрацияға ұқсас болды (5c-сурет).Бұл нәтижелер KAND 11 әртүрлі өсімдіктердің өсуін тежей алатынын көрсетеді.Содан кейін біз аю моноамидімен байланысты қосылыстардың басқа организмдердегі ықтимал цитотоксиктігін зерттедік, атап айтқанда, адам HeLa жасушалары және Escherichia coli штаммы DH5α, сәйкесінше жоғары жануар және бактерия жасушаларының өкілдері ретінде.Жасуша пролиферациясын талдау сериясында біз кумамонамид 1, кумамонамид қышқылы 6 және KAND 11 100 мкм концентрацияда HeLa немесе E. coli жасушаларының өсуіне әсер етпейтінін байқадық (5d,e-сурет).
Arabidopsis емес организмдердегі KAND 11 өсуін тежеу.(a) Екі апталық жабайы типті SR-1 темекі көшеттері құрамында 25 мкм KAND 11 бар тігінен орналасқан MS пластиналарында өсірілді. (b) Екі апталық жабайы типті SR-1 темекі көшеттері көлденең орналасқан жерде өсірілді. Құрамында 200 мкм KAND 11 бар MS пластиналары. (c) Gamborg B5 пластиналарында KAND 11 көрсетілген концентрацияларымен өсірілген екі апталық жабайы типті Tak-1 бауырқұрт бүршіктері. Қызыл көрсеткілер екі апталық инкубацияда өсуі тоқтаған спораларды көрсетеді. кезең.(d) HeLa жасушаларының жасуша пролиферациясын талдау.Тіршілікке қабілетті жасушалардың саны белгіленген уақыт аралықтарында жасушаларды санау жинағы 8 (Дожиндо) арқылы өлшенді.Бақылау ретінде HeLa жасушалары РНҚ полимераза транскрипциясын тежейтін және жасуша өлімін тудыратын 5 мкг/мл актиномицин D (Акт D) өңделген.Талдаулар үш данада орындалды.(e) E. coli жасушаларының пролиферациясын талдау.E. coli өсуі OD600 өлшеу арқылы талданды.Бақылау ретінде жасушалар бактериялық жасуша қабырғасының синтезін тежейтін 50 мкг/мл ампициллинмен (Amp) өңделді.Талдаулар үш данада орындалды.
Урамидпен байланысты қосылыстардан туындаған цитотоксикалық әсер ету механизмін ашу үшін біз орташа тежегіш әсері бар урбен қышқылының туындыларын қайта талдадық.суретте көрсетілгендей.2b, 6a суреттерінде көрсетілгендей, құрамында жоғары концентрацияда (200 мкМ) урмотоник қышқылы 6 бар агар пластиналарында өсірілген өскіндер қысқа және солға иілген тамырларды (θ = – 23,7 ± 6,1), ал бақылау қоректік ортада өсірілген өсінділерде көшеттер түзу дерлік тамырлар берді (θ = – 3,8 ± 7,1).Бұл тән қиғаш өсу қыртыстық микротүтікшелердің дисфункциясынан туындайтыны белгілі14,18.Осы тұжырымға сәйкес, микротүтіктерді тұрақсыздандыратын препараттар дизопирамид пен оризалин біздің өсу жағдайларымызда ұқсас тамырдың қисаюын тудырды (2б, 6а-суреттер).Сонымен бірге біз урмотоник қышқылының туындыларын сынап көрдік және олардың белгілі бір концентрацияларда қиғаш тамырдың өсуін тудыратын бірнешеуін таңдадық.8, 9 және 15 қосылыстар сәйкесінше 75 мкм, 50 мкм және 40 мкм тамыр өсу бағытын өзгертті, бұл бұл қосылыстар микротүтікшелерді тиімді түрде тұрақсыздандыратынын көрсетеді (2б, 6а-сурет).Біз сондай-ақ урзол қышқылының ең күшті туындысы KAND 11-ті төмен концентрацияда (15 мкМ) сынадық және KAND 11 қолдану тамырдың өсуін тежейтінін және тамырдың өсу бағытының біркелкі емес екенін анықтадық, бірақ олар солға қарай еңіске бейім болды ( C3 суреті)..Микротүтікшелерді тұрақсыздандыратын дәрілердің жоғары концентрациясы кейде тамырдың қисаюын тудырмай, өсімдіктердің өсуін тежейтіндіктен, біз кейіннен KAND 11 микротүтікшелерге әсер ету мүмкіндігін түбірлік эпидермис жасушаларында кортикальды микротүтікшелерді бақылау арқылы бағаладық.25 мкм KAND 11 өңделген өскін тамырларының эпидермис жасушаларында анти-β-тубулинді антиденелерді қолданатын иммуногистохимиялық зерттеу ұзарту аймағындағы эпидермис жасушаларында барлық дерлік қыртыстық микротүтікшелердің жоғалғанын көрсетті (6б-сурет).Бұл нәтижелер кумамотоник қышқылы мен оның туындылары микротүтікшелерге тікелей немесе жанама әсер етіп, оларды бұзады және бұл қосылыстардың жаңа микротүтік тежегіштері екенін көрсетеді.
Урсон қышқылы және оның туындылары Arabidopsis thalianaдағы кортикальды микротүтіктерді өзгертеді.(a) Көрсетілген концентрациялардағы әртүрлі урмотоник қышқылы туындыларының қатысуымен өлшенген тамырдың көлбеу бұрышы.Микротүтікшелерді тежейтін екі қосылыстардың әсері де талданған: дизопирамид пен оризалин.Кірістіру тамырдың өсу бұрышын өлшеу үшін қолданылатын стандартты көрсетеді.Жұлдызшалар жалған өңдеуден айтарлықтай айырмашылықтарды көрсетеді (t сынағы, б< 0,05).n>19. Масштаб жолағы = 1 см.б) созылу аймағындағы эпидермис жасушаларында қыртысты микротүтікшелер.25 мкм KAND 11 бар немесе онсыз MS пластиналарында өсірілген жабайы типтегі Arabidopsis Col тамырларындағы микротүтікшелер β-тубулинді бастапқы антиденелерді және Alexa Fluor конъюгацияланған қайталама антиденелерді пайдаланып иммуногистохимиялық бояу арқылы көрінді.Масштаб жолағы = 10 мкм.в) Тамыр меристемасындағы микротүтікшелердің митоздық құрылымы.Микротүтікшелер иммуногистохимиялық бояу арқылы визуалды.Митоздық құрылымдар, соның ішінде профазалық аймақтар, шпиндельдер және фрагмопластар конфокальды суреттерден есептелді.Көрсеткілер митоздық микротүтікше құрылымдарын көрсетеді.Жұлдызшалар жалған өңдеуден айтарлықтай айырмашылықтарды көрсетеді (t сынағы, б< 0,05).n>9. Масштаб жолағы = 50 мкм.
Урса микротүтіктердің қызметін бұзу мүмкіндігіне ие болғанымен, оның әсер ету механизмі әдеттегі микротүтіктерді деполимеризациялайтын агенттерден өзгеше болады деп күтілуде.Мысалы, дизопирамид және оризалин сияқты микротүтіктерді деполимеризациялаушы агенттердің жоғары концентрациясы эпидермис жасушаларының анизотропты кеңеюін тудырады, ал KAND 11 бұл емес.Сонымен қатар, KAND 11 мен дизопирамидті бірге қолдану дизопирамидпен индукцияланған түбір өсу реакциясына әкелді және KAND 11 индукцияланған өсу тежелуі байқалды (S4-сурет).Біз сондай-ақ жоғары сезімтал дизопирамид 1-1 (phs1-1) мутантының KAND 11-ге жауабын талдадық. phs1-1 канондық емес тубулинкиназа нүктелік мутацияға ие және дисопирамидпен өңделген кезде қысқа тамырлар шығарады9,20.KAND 11 бар агар ортасында өсірілген phs1-1 мутантты өскіндер дизопирамидада өсірілгендерге ұқсас қысқа тамырларға ие болды (S5 сурет).
Сонымен қатар, біз KAND 11-мен өңделген өскіндердің түбірлік меристемасында профазалық аймақтар, шпиндельдер және фрагмопластар сияқты митоздық микротүтікше құрылымдарын байқадық. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS бойынша бақылауларға сәйкес, айтарлықтай төмендеді. митоздық микротүтікшелердің саны байқалды (.6c-сурет).
КАНД 11 цитотоксикалық қасиетін жасушадан тыс ажырату кезінде сипаттау үшін біз темекінің BY-2 суспензия жасушаларын KAND 11-мен өңдеп, олардың реакциясын бақыладық.Біз алдымен KAND 11-ді микротүтікшелерді флуоресцентті түрде белгілейтін TagRFP-TUA6 экспрессиясы бар BY-2 жасушаларына KAND 11-нің кортикальды микротүтіктерге әсерін бағалау үшін қостық.Кортикальды микротүтіктердің тығыздығы цитоплазмалық пикселдер арасындағы цитоскелеттік пикселдердің пайызын сандық түрде анықтайтын кескінді талдау арқылы бағаланды.Талдау нәтижелері 1 сағат бойы 50 мкм немесе 100 мкм KAND 11 өңдеуден кейін тығыздық тиісінше 0,94 ± 0,74% немесе 0,23 ± 0,28% дейін айтарлықтай төмендегенін көрсетті, ал DMSO өңделген жасушалардың тығыздығы ± 10,61 құрады. % (7а-сурет).Бұл нәтижелер KAND 11 емі кортикальды микротүтікшелердің деполимеризациясын индукциялайтыны туралы Arabidopsis бақылауымен сәйкес келеді (6б-сурет).Біз сондай-ақ GFP-ABD таңбаланған актин жіптері бар BY-2 сызығын бірдей KAND 11 концентрациясымен өңдеуден кейін зерттедік және KAND 11 өңдеу актин талшықтарын бұзғанын байқадық.1 сағат бойы 50 мкм немесе 100 мкм KAND 11 өңдеу актин жіптерінің тығыздығын тиісінше 1,20 ± 0,62% немесе 0,61 ± 0,26% дейін айтарлықтай төмендетті, ал DMSO-мен өңделген жасушалардағы тығыздық 1,69 ± 2% (Fi.51) болды.7b).Бұл нәтижелер актин жіптеріне әсер етпейтін пропизамид пен микротүтіктерге әсер етпейтін актин деполимеризаторы латрункулин В әсерлерінен айырмашылығы бар (SI суреті S6).Сонымен қатар, кумамонамид 1, куманамид қышқылы 6 немесе KAND 11 емдеу HeLa жасушаларындағы микротүтіктерге әсер етпеді (SI суреті S7).Осылайша, KAND 11 әсер ету механизмі белгілі цитоскелеттерді бұзушылардан өзгеше деп есептеледі.Сонымен қатар, KAND 11-мен өңделген BY-2 жасушаларын микроскопиялық бақылауымыз KAND 11 емдеу кезінде жасуша өлімінің басталуын анықтады және Эванстың көк түске боялған өлі жасушаларының үлесі KAND 11 өңдеуден 30 минут өткеннен кейін айтарлықтай өспейтінін көрсетті. 50 мкМ немесе 100 мкм КАНД-пен 90 минуттық өңдеуден кейін өлі жасушалар саны сәйкесінше 43,7% немесе 80,1% дейін өсті (7c-сурет).Біріктірілген бұл деректер урзол қышқылының жаңа туындысы KAND 11 әрекет ету механизмі бұрын белгісіз болатын өсімдікке тән цитоскелеттік тежегіш екенін көрсетеді.
KAND кортикальды микротүтіктерге, актин жіпшелеріне және темекі BY-2 жасушаларының өміршеңдігіне әсер етеді.(a) TagRFP-TUA6 қатысуымен BY-2 жасушаларында кортикальды микротүтіктердің визуализациясы.KAND 11 (50 мкм немесе 100 мкм) немесе DMSO өңделген BY-2 жасушалары конфокальды микроскопия арқылы зерттелді.Кортикальды микротүтіктердің тығыздығы 25 тәуелсіз жасушаның микросуреттерінен есептелді.Әріптер елеулі айырмашылықтарды көрсетеді (Tukey HSD сынағы, б< 0,05).Масштаб жолағы = 10 мкм.(b) GFP-ABD2 қатысуымен бейнеленген BY-2 жасушаларындағы кортикальды актиндік жіптер.KAND 11 (50 мкм немесе 100 мкм) немесе DMSO өңделген BY-2 жасушалары конфокальды микроскопия арқылы зерттелді.Кортикальды актин жіптерінің тығыздығы 25 тәуелсіз жасушаның микросуреттерінен есептелді.Әріптер елеулі айырмашылықтарды көрсетеді (Tukey HSD сынағы, б< 0,05).Масштаб жолағы = 10 мкм.(c) Эванс көк бояуы арқылы өлі BY-2 жасушаларын бақылау.KAND 11 (50 мкм немесе 100 мкм) немесе DMSO өңделген BY-2 жасушалары жарқын өріс микроскопиясы арқылы зерттелді.n=3.Масштаб жолағы = 100 мкм.
Табиғи жаңа өнімдерді табу және қолдану адам өмірінің әртүрлі салаларында, соның ішінде медицина мен ауыл шаруашылығында айтарлықтай жетістіктерге әкелді.Табиғи ресурстардан пайдалы қосылыстар алу үшін тарихи зерттеулер жүргізілді.Атап айтқанда, актиномицеттер нематодтарға қарсы паразиттік антибиотиктер ретінде пайдалы екені белгілі, өйткені олардың әртүрлі қайталама метаболиттер, мысалы, авермектин, ивермектиннің қорғасын қосылысы және блеомицин және оның туындылары, ісікке қарсы агент ретінде медицинада қолданылады21,22.Сол сияқты, актиномицеттерден әртүрлі гербицидтік қосылыстар табылды, олардың кейбіреулері қазірдің өзінде коммерциялық мақсатта қолданылады1,23.Сондықтан қажетті биологиялық белсенділіктері бар табиғи өнімдерді бөліп алу үшін актиномицет метаболиттерін талдау тиімді стратегия болып саналады.Бұл зерттеуде біз S. werraensis-тен кумамонамид деген жаңа қосылыс тауып, оны сәтті синтездедік.Урсон қышқылы урбенамид пен оның туындыларының синтетикалық аралық өнімі болып табылады.Ол тән тамырдың бұралуын тудыруы мүмкін, орташа және күшті гербицидтік белсенділікті көрсетеді және өсімдік микротүтіктерін тікелей немесе жанама түрде зақымдауы мүмкін.Алайда урмотоник қышқылының әсер ету механизмі микротүтікшелердің қолданыстағы тежегіштерінен ерекшеленуі мүмкін, өйткені KAND 11 актин жіптерін де бұзады және жасуша өлімін тудырады, бұл урмотоник қышқылы мен оның туындылары цитоскелеттік құрылымдардың кең ауқымына әсер ететін реттеуші механизмді ұсынады..
Урбенон қышқылының одан әрі егжей-тегжейлі сипаттамасы урбенон қышқылының әсер ету механизмін жақсы түсінуге көмектеседі.Атап айтқанда, келесі мақсат - урсон қышқылының және оның туындыларының микротүтікшелерге тікелей әсер етіп, оларды деполимеризациялауын немесе олардың әсерінен микротүтікшелердің тұрақсыздануына әкелетінін анықтау үшін урсон қышқылының қысқартылған микротүтіктермен байланысу қабілетін бағалау.Сонымен қатар, микротүтікшелер тікелей нысана болмаған жағдайда, урсон қышқылының өсімдік жасушаларына әсер ету орнын және молекулалық нысандарын анықтау байланысты қосылыстардың қасиеттерін және гербицидтік белсенділікті жақсартудың ықтимал жолдарын одан әрі түсінуге көмектеседі.Біздің биобелсенділік талдауымыз арабидопсис thaliana, темекі және бауыр құрттары сияқты өсімдіктердің өсуіне урсон қышқылының бірегей цитотоксикалық қабілетін көрсетті, ал E. coli де, HeLa жасушалары да әсер етпеді.Жануарлар жасушаларына уыттылығының аздығы немесе мүлдем болмауы урсон қышқылы туындыларының артықшылығы болып табылады, егер олар ашық ауылшаруашылық алқаптарында пайдалану үшін гербицидтер ретінде жасалған болса.Шынында да, микротүтікшелер эукариоттарда кең таралған құрылымдар болғандықтан, олардың өсімдіктерде селективті тежелуі гербицидтерге қойылатын негізгі талап болып табылады.Мысалы, тубулинмен тікелей байланысатын және полимерленуді тежейтін микротүтіктерді деполимерлеуші пропизамид жануар жасушаларына аз уытты болғандықтан гербицид ретінде қолданылады24.Дизопирамидтен айырмашылығы, тиісті бензамидтердің әртүрлі мақсатты ерекшеліктері бар.Өсімдік микротүтіктерінен басқа, RH-4032 немесе бензоксамид сәйкесінше жануарлар жасушаларының немесе оомицеттердің микротүтіктерін тежейді, фитоуыттылығы төмен болғандықтан залиламид фунгицид ретінде қолданылады25,26,27.Жаңадан ашылған аю және оның туындылары өсімдіктерге қарсы селективті цитотоксикалық әсер көрсетеді, бірақ келесі модификациялар олардың мақсатты ерекшелігін өзгертуі мүмкін, бұл патогендік саңырауқұлақтармен немесе омицеттермен күресу үшін ықтимал қосымша туындылар беретінін атап өткен жөн.
Урбен қышқылының және оның туындыларының бірегей қасиеттері оларды гербицидтер ретінде әзірлеу және зерттеу құралы ретінде пайдалану үшін пайдалы.Өсімдік жасушасының пішінін басқарудағы цитоскелеттің маңыздылығы кеңінен танылған.Бұрынғы зерттеулер өсімдіктердің морфогенезді дұрыс басқару үшін микротүтікше динамикасын бақылай отырып, кортикальды микротүтіктерді ұйымдастырудың күрделі механизмдерін дамытқанын көрсетті.Микротүтікшелердің белсенділігін реттеуге жауапты көптеген молекулалар анықталды және осыған байланысты зерттеулер әлі де жалғасуда3,4,28.Өсімдік жасушаларындағы микротүтіктердің динамикасы туралы қазіргі түсінігіміз кортикальды микротүтікшелердің ұйымдастырылу механизмдерін толық түсіндіре алмайды.Мысалы, дизопирамид те, оризалин де микротүтіктерді деполимеризациялай алатынымен, дизопирамид тамырдың қатты бұрмалануын тудырады, ал оризалин салыстырмалы түрде жұмсақ әсер етеді.Сонымен қатар, микротүтікшелерді тұрақтандыратын тубулиндегі мутациялар да тамырлардың декстроротациясын тудырады, ал микротүтіктердің динамикасын тұрақтандыратын паклитакселде жоқ.Сондықтан урсол қышқылының молекулалық мақсаттарын зерттеу және анықтау өсімдік кортикальды микротүтікшелерінің реттелуі туралы жаңа түсініктерді қамтамасыз етуі керек.Сол сияқты, дизопирамид сияқты бұрмаланған өсуді ілгерілетуде тиімді химиялық заттарды және оризалин немесе кумамотор қышқылы сияқты тиімдірек емес химиялық заттарды болашақта салыстыру бұрмаланған өсудің пайда болуы туралы анықтама береді.
Екінші жағынан, қорғаныспен байланысты цитоскелеттік қайта құрулар урсон қышқылының цитотоксикалық әсерін түсіндірудің тағы бір мүмкіндігі болып табылады.Қоздырғышты жұқтыру немесе өсімдік жасушаларына элиситорды енгізу кейде цитоскелеттің бұзылуына және кейіннен жасуша өліміне әкеледі29.Мысалы, омицеттерден алынған криптоксантин темекі жасушалары өлгенге дейін микротүтікшелер мен актин жіпшелерін бұзады, бұл KAND емінде болатын жағдайға ұқсас30,31.Урсон қышқылынан туындаған қорғаныс реакциялары мен жасушалық жауаптар арасындағы ұқсастықтар бізді олар жалпы жасушалық процестерді қоздырады деген гипотеза жасауға әкелді, дегенмен урсон қышқылының криптоксантинге қарағанда жылдам және күшті әсері айқын.Дегенмен, зерттеулер актин жіптерінің бұзылуы жасушалардың өздігінен өлуіне ықпал ететінін көрсетті, бұл әрқашан микротүтіктердің бұзылуымен бірге жүрмейді29.Бұған қоса, патоген немесе элиситор урсон қышқылының туындылары сияқты тамырдың бұрмаланған өсуіне себепші ме, соны анықтау керек.Осылайша, қорғаныс реакциялары мен цитоскелетті байланыстыратын молекулалық білім шешуге болатын тартымды мәселе болып табылады.Урсон қышқылына қатысты төмен молекулалық салмақты қосылыстардың, сондай-ақ әртүрлі потенциалы бар туындылардың ауқымын пайдалану арқылы олар белгісіз жасушалық механизмдерді нысанаға алу мүмкіндігін бере алады.
Бірге алғанда, микротүтіктердің динамикасын модуляциялайтын жаңа қосылыстардың ашылуы және қолданылуы өсімдік жасушаларының пішінін анықтау негізінде жатқан күрделі молекулалық механизмдерді шешудің күшті әдістерін қамтамасыз етеді.Осы контекстте микротүтікшелер мен актин жіпшелеріне әсер ететін және жасуша өлімін тудыратын жақында жасалған қосылыс урмотоник қышқылы микротүтіктерді басқару мен осы басқа механизмдер арасындағы байланысты шешуге мүмкіндік береді.Осылайша, урбенон қышқылын қолданатын химиялық және биологиялық талдау өсімдік цитоскелеттерін басқаратын молекулалық реттеу механизмдерін түсінуге көмектеседі.
S. werraensis MK493-CF1 егіңіз, құрамында 2% (салм/көлем) галактоза, 2% (салм/көлем) эссенция пастасы, 1% (сал/көлем) Bacto құрамы бар 110 мл тұқымдық ортасы бар 500 мл шағылысқан Эрленмейер колбасына егіңіз. .-сойтон (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (салм/көлем) жүгері сығындысы (KOGOSTCH Co., Ltd., Жапония), 0,2% (салм/көлем) (NH4)2SO4 және 0,2% CaCO3 деиондандырылған суда.(стерильдеу алдында pH 7,4).Тұқым дақылдары айналмалы шайқағышта (180 айн/мин) 27°C температурада 2 күн бойы инкубацияланды.Қатты күйдегі ашыту арқылы өнімді өсіру.Тұқым культурасы (7 мл) 15 г сығымдалған арпа (MUSO Co., Ltd., Жапония) және 25 г ионсыздандырылған судан (рН реттелмеген) тұратын 40 г өндірістік ортасы бар 500 мл K-1 колбасына ауыстырылды. зарарсыздандыру алдында).).Ашыту 30°C температурада қараңғы жерде 14 күн бойы жүргізілді.Ашыту материалы 40 мл/бөтелке EtOH-мен экстракцияланды және центрифугадан өтті (1500 г, 4°C, 10 мин).Культура үстіңгі заты (60 мл) 10% MeOH/EtOAc қоспасымен экстракцияланды.Органикалық қабат қалдық (59,5 мг) алу үшін төмендетілген қысым астында буландырылды, ол кері фазалық бағандағы (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 мкм, ID 10 мм × ұзындығы 250 мм) H2O/CH3CN, 10–35 минут: 90% H2O/CH3CN – 70% H2O/CH3CN (градиент), 35–45 минут: 90% H2O/EtOH, 45–155 минут: 90% H2O /EtOH-дан 100% EtOH-ға (градиент (градиент), 155–200 мин: 100% EtOH) 1,5 мл/мин ағын жылдамдығында, кумамонамид (1, 36,0 мг) ақ аморфты ұнтақ ретінде бөлініп алынды.
Кумамотамид(1);1H-NMR (500 МГц, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Гц, 1Н), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Гц 1Н), 6,05 (t , J = 3,8 Гц, 1Н).), 4,08 (с, 3Н);13С-ЯМР (125 МГц, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ есептелген мән: 141,0659, өлшенген мән: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 113 см.
Колумбия тұқымдары (Col-0) Арабидопсис биологиялық ресурстық орталығынан (ABRC) зерттеуге рұқсатпен алынды.Col-0 тұқымдары біздің зертханалық жағдайларда көбейтілді және сақталды және жабайы типтегі арабидопсис өсімдіктері ретінде пайдаланылды.Арабидопсис тұқымдары беті зарарсыздандырылды және құрамында 2% сахароза (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (салм/көлем) 2-(4-морфолино)этансульфон қышқылы (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) бар жартылай беріктігі Murashige және Skoog орталарында өсірілді. ).) және 1,5% агар (Fujifilm Wako Pure Chemical), рН 5,7, 23 °C және тұрақты жарықта.Phs1-1 мутантының тұқымдарын Т.Хашимото (Нара ғылым және технология институты) ұсынды.
SR-1 штаммының тұқымдарын Т.Хашимото (Нара ғылым және технология институты) ұсынды және жабайы типтегі темекі өсімдіктері ретінде пайдаланылды.Темекі тұқымдары өнуін жақсарту үшін бетін зарарсыздандырды және үш түн бойы стерильді суға малынған, содан кейін құрамында 2% сахароза, 0,05% (салм/көлем) MES және 0,8% геллан сағызы (Fujifilm Wako Pure Chemical) бар жартылай күшті ерітіндіге орналастырылған. Мурашиге.және Skoog ортасы) рН 5,7 және тұрақты жарықта 23°C инкубацияланады.
Так-1 штаммын Т. Кохчи (Киото университеті) қамтамасыз етті және ол бауыр құрттарын зерттеу үшін стандартты тәжірибелік блок ретінде пайдаланылды.Гемма зарарсыздандырылған өсірілген өсімдіктерден алынды, содан кейін құрамында 1% сахароза және 0,3% геллан сағызы бар Gamborg B5 ортасына (Fujifilm Wako Pure Chemical) қапталды және 23°C үздіксіз жарық астында инкубацияланды.
Темекі BY-2 жасушалары (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) С. Хасезава (Токио университеті) ұсынған.BY-2 жасушалары модификацияланған Linsmeier және Skoog орталарында 95 есе сұйылтылған және апта сайын 2,4-дихлорфеноксисірке қышқылымен 32 толықтырылған.Жасуша суспензиясы қараңғыда 27°C температурада 130 айн/мин жылдамдықпен айналмалы шайқағышта араластырылды.Жасушаларды 10 есе үлкен жаңа ортамен жуыңыз және сол ортада қайта суспендиялаңыз.Түсті қырыққабат мозаикалық вирусының 35S промоутері астында TagRFP-TUA6 микротүтікше маркерін немесе актин жіп маркерін GFP-ABD2 тұрақты экспрессиялайтын BY-2 трансгенді жасуша желілері сипатталғандай жасалды33,34,35.Бұл ұяшық сызықтарын бастапқы BY-2 ұяшық сызығы үшін пайдаланылатындарға ұқсас процедуралар арқылы сақтауға және синхрондауға болады.
HeLa жасушалары 5% CO2 бар 37°C инкубаторында 10% ұрықтың ірі қара сарысуымен, 1,2 U/мл пенициллинмен және 1,2 мкг/мл стрептомицинмен толықтырылған Dulbecco өзгертілген Eagle's ортасында (DMEM) (Life Technologies) өсірілді.
Осы қолжазбада сипатталған барлық эксперименттер жапондық биологиялық қауіпсіздік ережелері мен нұсқауларына сәйкес орындалды.
Қосылыстар қор ерітінділері ретінде диметил сульфоксидте (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) ерітілді және Арабидопсис пен темекіге арналған MS ортасында немесе бауыр сусыны үшін Gamborg B5 ортасында сұйылтылды.Тамырдың өсуін тежеу талдауы үшін көрсетілген қосылыстар немесе DMSO бар агар ортасына бір пластинаға 10-нан астам тұқым себілді.Тұқымдар өсу камерасында 7 күн бойы инкубацияланды.Көшеттерді суретке түсіріп, тамырлардың ұзындығын өлшейді.Arabidopsis өну талдауы үшін 200 мкм қосылыс немесе DMSO бар агар ортасына бір пластинаға 48 тұқым себілді.Арабидопсис тұқымы өсу камерасында өсірілді және өнген өскіндердің саны өнгеннен кейін 7 күннен кейін есептелді (даг).Темекінің өнуін талдау үшін әрбір пластинаға 24 тұқым 200 мкм KAND немесе DMSO бар агар ортасына себілді.Темекі тұқымдары өсу камерасында өсіріліп, 14 күннен кейін өнген көшеттердің саны есептелді.Бауыр құртының өсуін тежеу талдауы үшін әрбір пластинадан 9 эмбрион құрамында KAND немесе DMSO көрсетілген концентрациялары бар агар ортасына салынып, өсу камерасында 14 күн бойы инкубацияланды.
Тамыр меристемасының ұйымдастырылуын визуализациялау үшін 5 мг/мл пропидий йодидімен (PI) боялған көшеттерді пайдаланыңыз.PI сигналдары TCS SPE конфокальды лазерлік сканерлеу микроскопының (Leica Microsystems) көмегімен флуоресцентті микроскопия арқылы байқалды.
Тамырларды β-глюкуронидазамен (GUS) гистохимиялық бояу Малами және Бенфей сипаттаған хаттамаға сәйкес орындалды36.Көшеттер түні бойы 90% ацетонда бекітіліп, GUS буферінде 0,5 мг/мл 5-бром-4-хлоро-3-индолил-β-д-глюкурон қышқылымен 1 сағат бойы боялған және гидратталған хлоральдегид ерітіндісіне орналастырылған.(8 г хлоралгидрат, 2 мл су және 1 мл глицерин) және Axio Imager M1 микроскопының (Карл Цейс) көмегімен дифференциалды интерференциялық контрастты микроскопия арқылы бақыланады.
Тігінен орналастырылған тақтайшаларда өсірілген 7 күндік көшеттерде тамыр бұрыштары өлшенді.6-қадамда сипатталғандай, ауырлық векторының бағыты бойынша түбірдің бұрышын өлшеңіз.
Кортикальды микротүтікшелердің орналасуы сипатталғандай байқалды, 37 хаттамаға аздаған өзгерістер енгізілді.Анти-β-тубулин антиденесі (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) және Alexa Fluor 488 конъюгацияланған тышқанға қарсы IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) 1:1000 және 1:10 сұйылту кезінде бастапқы және қайталама антиденелер ретінде пайдаланылды. тиісінше.Флуоресценциялық кескіндер TCS SPE конфокальды лазерлік сканерлеу микроскопының (Leica Microsystems) көмегімен алынды.Z-стек кескіндерін алыңыз және өндірушінің нұсқауларына сәйкес максималды қарқындылық проекцияларын жасаңыз.
HeLa жасушаларының пролиферациясын талдау өндірушінің нұсқауларына сәйкес Cell Counting Kit 8 (Dojindo) көмегімен орындалды.
E. coli DH5α өсуі 600 нм (OD600) диапазонында спектрофотометрдің көмегімен культурадағы жасуша тығыздығын өлшеу арқылы талданған.
Трансгендік BY-2 жасушаларындағы цитоскелеттік ұйым CSU-X1 конфокальды сканерлеу құрылғысымен (Йокогава) және sCMOS камерасымен (Zyla, Andor Technology) жабдықталған флуоресцентті микроскоптың көмегімен байқалды.Цитоскелеттік тығыздық кескінді талдау арқылы бағаланды, ол сипатталғандай ImageJ бағдарламалық құралын пайдаланып конфокальды кескіндердегі цитоплазмалық пикселдер арасындағы цитоскелеттік пикселдердің пайызын сандық түрде анықтады38,39.
BY-2 жасушаларында жасуша өлімін анықтау үшін жасуша суспензиясының аликвоты бөлме температурасында 10 минут бойы 0,05% Эванс көгімен инкубацияланды.Өлі жасушалардың таңдамалы Эванс көгілдір бояуы өміршең жасушалардан бояғыштың бұзылмаған плазмалық мембрана арқылы экструзиясына байланысты40.Боялған жасушалар жарық өрісті микроскоптың (BX53, Olympus) көмегімен байқалды.
HeLa жасушалары 10% FBS қосылған DMEM-де 37°C және 5% CO2 ылғалдандырылған инкубаторда өсірілді.Жасушалар 6 сағат бойы 37°C температурада 100 мкм КАНД 11, кумамонам қышқылы 6, кумамонамид 1, 100 нг/мл кольцемид (Гибко) немесе 100 нг/мл Nocodmaze (Sigma) ерітіндісімен өңделген.Жасушалар бөлме температурасында 10 минут бойы MetOH, содан кейін ацетатпен 5 минут бойы бекітілді.Бекітілген жасушалар 2 сағат бойы 0,5% BSA/PBS сұйылтылған β-тубулинді бастапқы антиденемен (1D4A4, Proteintech: 66240-1) инкубацияланды, TBST көмегімен 3 рет жуылды, содан кейін Alexa Fluor ешкі антиденесімен инкубацияланды.488 1 сағат.– Тінтуір IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) және 0,5% BSA/PBS сұйылтылған 15 нг/мл 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI).TBST-пен үш рет жуғаннан кейін боялған жасушалар Nikon Eclipse Ti-E инверттелген микроскопында байқалды.Суреттер MetaMorph бағдарламалық құралының (Молекулалық құрылғылар) көмегімен салқындатылған Hamamatsu ORCA-R2 CCD камерасымен түсірілді.
Жіберу уақыты: 17 маусым 2024 ж